Хронобиологические аспекты в онкологии, хроноонкология
До настоящего времени одним из актуальных в онкологии остается вопрос о путях повышения эффективности химиотерапии рака. Несмотря на успехи, достигнутые в хирургической практике лечения злокачественных опухолей при раке груди, химиотерапия при бластоматозных процессах в некоторых ситуациях выступает на передний план, хотя иногда ее эффективность весьма проблематична. Одним из путей оптимизации химиотерапевтического лечения онкологических больных может быть хронобиологический подход. Ранее нами были сформулированы три основных принципа назначения препарата при экспериментальной хронотерапии рака: 1) в часы суток, когда большая часть опухолевых клеток находится в той фазе митотического цикла, которая наиболее чувствительна к данному препарату; 2) в часы суток, когда пролиферирующие клетки нормальных тканей наименее подвержены цитостатическому воздействию данного препарата; 3) в часы суток, когда его токсическое действие на весь организм наименее выражено.
Все эти три момента могут находиться в различной корреляции между собой, поэтому оптимальными могут явиться те часы суток, когда лечебный эффект препарата максимален, а цитостатическое действие на, нормальные клетки и токсическое на организм минимально. К сожалению, даже в экспериментальной практике это не всегда имеет место. И все-таки необходимо отметить, что в 1960-1970 гг. как в нашей стране (причем отечественные исследования, безусловно, являются приоритетными), так и за рубежом число таких экспериментальных работ, выполненных на животных, было весьма значительным. Результаты обнадеживали, так как удавалось при назначении препаратов в определенные часы по сравнению с общепризнанной методикой повысить их эффективность в 2- 3 раза, что выражалось в уменьшении размера опухолей, увеличении торможения роста опухолей, продолжительности сроков жизни и числа вылеченных животных. Подробный анализ достижений в области экспериментальной хроноонкологии за истекший период дан в публикациях Ефимова М. Л. Сейчас мы остановимся на основных принципах и путях реализации хронобиологического подхода в лечении опухолевого процесса. Однако с самого начала надо оговориться, что методические приемы с позиций биоритмологии могут применяться только в том случае, если процессы, на которые мы хотим повлиять, имеют выраженную периодичность. Только в этом случае «фактор времени» приобретает значимую, а в ряде случаев и решающую роль.
Если в отношении нормальных тканей наличие суточной периодичности интенсивности процессов клеточного размножения можно считать установленным (еще в 1964 г. И. А. Алов опубликовал обширный материал, из которого видно, что у ночных животных максимум митотической активности приходится на утренние часы, а минимум на вечерне-ночные), то данные литературы о ритме клеточных делений в опухолях неоднотипны.
В экспериментальной онкологии используют, как правило, три вида опухолей: спонтанные, индуцированные и перевариваемые. Анализ данных литературы показывает, что одни авторы не обнаружили изменений числа митозов в разные часы суток в указанных опухолях, а другие выявили суточную периодичность митотической активности. Разноречивость результатов можно объяснить несколькими причинами. Во-первых, можно полагать, что в опухолях отсутствует ритмичность клеточного размножения. Так, на ранних этапах этих исследований существовало мнение, что в процессе канцерогенеза происходят нарушения внутриклеточных регуляторных механизмов, в результате чего утрачивается суточная периодичность деления клеток, присущая нормальным тканям. Исходя из этого, был сделан вывод об автономности злокачественного роста. Однако в последующих исследованиях большинство авторов обнаружили суточный ритм митозов, причем стало преобладать мнение о том, что суточная периодичность митотической активности свидетельствует в пользу того, что опухоли в процессе своего роста и развития полностью не выходят из-под контроля нейрогуморальной регуляции организма.
Чем же в этом случае можно объяснить разноречивость данных литературы? Тщательный анализ работ, в которых не было обнаружено различий в числе митозов в разные часы суток, выявил некорректность (а в ряде случаев и несостоятельность) методических приемов исследования. Подсчет митозов в опухолях на протяжении суток - это кропотливый и трудоемкий процесс, требующий соблюдения определенных правил для получения статистически значимого результата. Так, изучение митотической активности необходимо производить 6-8 раз в сутки (забой через 4-3 ч), на срок использовать не менее 6-10 животных, просчитывать 5000-10 000 ядер на одно животное, просматривать 100-300 полей зрения на препарате, результаты обрабатывать приемлемым статистическим методом. Кроме того, митозы, особенно в опухолях, необходимо подсчитывать раздельно по фазам: профазы, метафазы, анафазы, телофазы. Учитывая большое число ранних профаз, их надо или регистрировать отдельно, или вообще не подсчитывать. Весьма важным также является проведение исследования в гистологически однородных зонах опухолей, в частности без некроза. Поскольку регионарные колебания числа митозов в опухолях довольно значительные, то различия в количестве делящихся клеток в разных участках одной опухоли могут искажать истинную картину митотической активности при сравнении ее с таковой в опухоли, взятой на исследование в другие часы суток.
Наконец, в связи с тем что подсчет митозов на срок исследования идет у нескольких животных, особое значение приобретает тот факт, чтобы опухоли у них были на одной и той же или близких стадиях роста, иначе индивидуальные колебания могут нивелировать суточные различия. Несоблюдение хотя бы одного из перечисленных положений не может гарантировать истинности полученных результатов. В работах же большинства авторов, не обнаруживших суточного ритма митозов, как раз и не выполнялись указанные правила (исследование проводили 2-4 раза в сутки, брали малое число животных на срок, просчитывали только 1000 ядер и т. д.).
В абсолютном большинстве перевиваемых опухолей обнаружен отчетливый одновершинный суточный ритм митозов, что не наблюдается в спонтанных и индуцированных опухолях. Это еще раз подтверждает высказанное выше мнение о том, что исследуемые опухоли не должны быть на различных стадиях своего роста и развития. Такая постановка вопроса возможна при исследовании перевиваемых опухолей, которые «прививают» всем подопытным животным в один и тот же день, в определенное время, равным количеством клеток. Спонтанные и индуцированные опухоли определяются и возникают в разные дни с начала исследования. Следовательно, к моменту забоя животных они находятся на различных стадиях роста и развития. Это, очевидно, и затрудняет получение статистически значимых различий.
В тех же случаях, когда ритм в спонтанных и индуцированных опухолях обнаруживался, он был двухвершинным, причем один максимум митотической активности наблюдался в утренние и дневные часы (10-12-16 ч), а другой - в вечерне-ночные (20-02-04 ч). Нетрудно заметить, что первый пик отмечен в общем-то в тот же период суток, на который приходится максимум митозов в нормальных тканях, а второй пик отмечен в часы, когда в большинстве тканей организма наблюдается низкий уровень клеточной пролиферации.
Двухвершинность ритма делящихся клеток на протяжении суток была обнаружена и в перевиваемой асцитной опухоли Эрлиха - с максимумом в 06 и 12 ч и в 04 и 12 ч, хотя не надо забывать, что асцитные опухоли характеризуются значительной гетерогенностью. Анализируя возможные причины появления двухвершинности ритма в опухолях, мы предположили, что малигнизированые клетки в один период суток «идут» в митоз «по старой памяти», как и нормальные клетки, а в другой период «выход» в митоз является следствием нарушения внутриклеточных механизмов в процессе канцерогенеза. В подтверждение этого представления можно привести данные, полученные в последующее время, об изменении характера клеточной кинетики в процессе роста и развития опухоли.
Оказалось, что если на 4-й день роста асцитной опухоли яичника крыс наблюдается монофазный ритм числа делящихся клеток с максимумом в 22 ч, то через 9 дней после перевивки появляется дополнительный пик в 12 ч и ритм становится двухфазным. Особый интерес в этом плане представляют данные А. Г. Мустафина, изучавшего суточные ритмы митотической активности и синтеза ДНК в процессе гепатоканцерогенеза. Оказалось, что у мышей, обработанных орто-аминоазотолуолом, в нормальных гепатоцитах и на первой стадии канцерогенеза наблюдается одновершинный ритм числа ДНК-синтезирующих клеток с максимумом в 16 ч. Однако уже на стадии очаговых пролифератов появляется второй максимум в 04 ч, который сохраняется в первичной гепатоме, т. е. ритм синтеза ДНК приобретает двухвершинный характер с максимумом в 16 и 04 ч. Отметим, что суточный ритм митотической активности на всех стадиях наблюдения одновершинный с наибольшим числом митозов в 04-10 ч. К сожалению, не известно, какой характер имеют ритмы митозов и синтеза ДНК на более поздних стадиях канцерогенеза.
Исходя из изложенного, можно полагать, что если в процессе канцерогенеза происходят нарушения внутриклеточных регуляторных механизмов, как это считают многие авторы, то эти нарушения ведут, очевидно, не столько к исчезновению ритма, сколько к изменению его характера.
Все эти три момента могут находиться в различной корреляции между собой, поэтому оптимальными могут явиться те часы суток, когда лечебный эффект препарата максимален, а цитостатическое действие на, нормальные клетки и токсическое на организм минимально. К сожалению, даже в экспериментальной практике это не всегда имеет место. И все-таки необходимо отметить, что в 1960-1970 гг. как в нашей стране (причем отечественные исследования, безусловно, являются приоритетными), так и за рубежом число таких экспериментальных работ, выполненных на животных, было весьма значительным. Результаты обнадеживали, так как удавалось при назначении препаратов в определенные часы по сравнению с общепризнанной методикой повысить их эффективность в 2- 3 раза, что выражалось в уменьшении размера опухолей, увеличении торможения роста опухолей, продолжительности сроков жизни и числа вылеченных животных. Подробный анализ достижений в области экспериментальной хроноонкологии за истекший период дан в публикациях Ефимова М. Л. Сейчас мы остановимся на основных принципах и путях реализации хронобиологического подхода в лечении опухолевого процесса. Однако с самого начала надо оговориться, что методические приемы с позиций биоритмологии могут применяться только в том случае, если процессы, на которые мы хотим повлиять, имеют выраженную периодичность. Только в этом случае «фактор времени» приобретает значимую, а в ряде случаев и решающую роль.
Если в отношении нормальных тканей наличие суточной периодичности интенсивности процессов клеточного размножения можно считать установленным (еще в 1964 г. И. А. Алов опубликовал обширный материал, из которого видно, что у ночных животных максимум митотической активности приходится на утренние часы, а минимум на вечерне-ночные), то данные литературы о ритме клеточных делений в опухолях неоднотипны.
В экспериментальной онкологии используют, как правило, три вида опухолей: спонтанные, индуцированные и перевариваемые. Анализ данных литературы показывает, что одни авторы не обнаружили изменений числа митозов в разные часы суток в указанных опухолях, а другие выявили суточную периодичность митотической активности. Разноречивость результатов можно объяснить несколькими причинами. Во-первых, можно полагать, что в опухолях отсутствует ритмичность клеточного размножения. Так, на ранних этапах этих исследований существовало мнение, что в процессе канцерогенеза происходят нарушения внутриклеточных регуляторных механизмов, в результате чего утрачивается суточная периодичность деления клеток, присущая нормальным тканям. Исходя из этого, был сделан вывод об автономности злокачественного роста. Однако в последующих исследованиях большинство авторов обнаружили суточный ритм митозов, причем стало преобладать мнение о том, что суточная периодичность митотической активности свидетельствует в пользу того, что опухоли в процессе своего роста и развития полностью не выходят из-под контроля нейрогуморальной регуляции организма.
Чем же в этом случае можно объяснить разноречивость данных литературы? Тщательный анализ работ, в которых не было обнаружено различий в числе митозов в разные часы суток, выявил некорректность (а в ряде случаев и несостоятельность) методических приемов исследования. Подсчет митозов в опухолях на протяжении суток - это кропотливый и трудоемкий процесс, требующий соблюдения определенных правил для получения статистически значимого результата. Так, изучение митотической активности необходимо производить 6-8 раз в сутки (забой через 4-3 ч), на срок использовать не менее 6-10 животных, просчитывать 5000-10 000 ядер на одно животное, просматривать 100-300 полей зрения на препарате, результаты обрабатывать приемлемым статистическим методом. Кроме того, митозы, особенно в опухолях, необходимо подсчитывать раздельно по фазам: профазы, метафазы, анафазы, телофазы. Учитывая большое число ранних профаз, их надо или регистрировать отдельно, или вообще не подсчитывать. Весьма важным также является проведение исследования в гистологически однородных зонах опухолей, в частности без некроза. Поскольку регионарные колебания числа митозов в опухолях довольно значительные, то различия в количестве делящихся клеток в разных участках одной опухоли могут искажать истинную картину митотической активности при сравнении ее с таковой в опухоли, взятой на исследование в другие часы суток.
Наконец, в связи с тем что подсчет митозов на срок исследования идет у нескольких животных, особое значение приобретает тот факт, чтобы опухоли у них были на одной и той же или близких стадиях роста, иначе индивидуальные колебания могут нивелировать суточные различия. Несоблюдение хотя бы одного из перечисленных положений не может гарантировать истинности полученных результатов. В работах же большинства авторов, не обнаруживших суточного ритма митозов, как раз и не выполнялись указанные правила (исследование проводили 2-4 раза в сутки, брали малое число животных на срок, просчитывали только 1000 ядер и т. д.).
В абсолютном большинстве перевиваемых опухолей обнаружен отчетливый одновершинный суточный ритм митозов, что не наблюдается в спонтанных и индуцированных опухолях. Это еще раз подтверждает высказанное выше мнение о том, что исследуемые опухоли не должны быть на различных стадиях своего роста и развития. Такая постановка вопроса возможна при исследовании перевиваемых опухолей, которые «прививают» всем подопытным животным в один и тот же день, в определенное время, равным количеством клеток. Спонтанные и индуцированные опухоли определяются и возникают в разные дни с начала исследования. Следовательно, к моменту забоя животных они находятся на различных стадиях роста и развития. Это, очевидно, и затрудняет получение статистически значимых различий.
В тех же случаях, когда ритм в спонтанных и индуцированных опухолях обнаруживался, он был двухвершинным, причем один максимум митотической активности наблюдался в утренние и дневные часы (10-12-16 ч), а другой - в вечерне-ночные (20-02-04 ч). Нетрудно заметить, что первый пик отмечен в общем-то в тот же период суток, на который приходится максимум митозов в нормальных тканях, а второй пик отмечен в часы, когда в большинстве тканей организма наблюдается низкий уровень клеточной пролиферации.
Двухвершинность ритма делящихся клеток на протяжении суток была обнаружена и в перевиваемой асцитной опухоли Эрлиха - с максимумом в 06 и 12 ч и в 04 и 12 ч, хотя не надо забывать, что асцитные опухоли характеризуются значительной гетерогенностью. Анализируя возможные причины появления двухвершинности ритма в опухолях, мы предположили, что малигнизированые клетки в один период суток «идут» в митоз «по старой памяти», как и нормальные клетки, а в другой период «выход» в митоз является следствием нарушения внутриклеточных механизмов в процессе канцерогенеза. В подтверждение этого представления можно привести данные, полученные в последующее время, об изменении характера клеточной кинетики в процессе роста и развития опухоли.
Оказалось, что если на 4-й день роста асцитной опухоли яичника крыс наблюдается монофазный ритм числа делящихся клеток с максимумом в 22 ч, то через 9 дней после перевивки появляется дополнительный пик в 12 ч и ритм становится двухфазным. Особый интерес в этом плане представляют данные А. Г. Мустафина, изучавшего суточные ритмы митотической активности и синтеза ДНК в процессе гепатоканцерогенеза. Оказалось, что у мышей, обработанных орто-аминоазотолуолом, в нормальных гепатоцитах и на первой стадии канцерогенеза наблюдается одновершинный ритм числа ДНК-синтезирующих клеток с максимумом в 16 ч. Однако уже на стадии очаговых пролифератов появляется второй максимум в 04 ч, который сохраняется в первичной гепатоме, т. е. ритм синтеза ДНК приобретает двухвершинный характер с максимумом в 16 и 04 ч. Отметим, что суточный ритм митотической активности на всех стадиях наблюдения одновершинный с наибольшим числом митозов в 04-10 ч. К сожалению, не известно, какой характер имеют ритмы митозов и синтеза ДНК на более поздних стадиях канцерогенеза.
Исходя из изложенного, можно полагать, что если в процессе канцерогенеза происходят нарушения внутриклеточных регуляторных механизмов, как это считают многие авторы, то эти нарушения ведут, очевидно, не столько к исчезновению ритма, сколько к изменению его характера.