Химиотерапия раковых опухолей в рамках хронобиологического подхода
Рассмотрим основные положения хронобиологического подхода в экспериментальной химиотерапии рака на примере собственных результатов и некоторых данных литературы. При изучении митотической активности в перевиваемой (внутримышечно) карциноме преджелудка (штамм ОЖ-5) у мышей линии С3НА мы выявили отчетливый суточный ритм митозов с максимумом их числа в 10-13 ч и минимумом в 22-01ч. Суточный ритм делящихся клеток в опухоли был сходным с ритмом митозов в нормальном преджелудке у здоровых (интактных) мышей и у мышей, которым была перевита опухоль. Данный факт свидетельствует в пользу того, что изучаемая карцинома не выходит из-под контроля систем, регулирующих процессы пролиферации, поскольку большая часть популяции и малигнизированных и нормальных клеток преджелудка проходит фазу деления митотического цикла в один и тот же период суток (в 07-13 ч).
Максимальное число делящихся клеток в опухоли (20,6%) в 10 ч превосходит минимальное (8,5%) в 01 ч в 2,4 раза. Обращает на себя внимание и то, что среднесуточный уровень митозов (13,2%) в карциноме в 3,6 раза выше, чем в нормальном преджелудке (3,7%о), что на первый взгляд свидетельствует о более высокой пролиферативной активности в опухоли. Вместе с тем в литературе встречались сообщения о том, что на протяжении суток изменяется не только число клеток, вступающих в деление, но и длительность самого митоза. В связи с этим делался вывод о том, что определяемая митотическая активность есть не что иное, как отражение длительности митоза. В часы суток, когда время течения митоза больше, мы и регистрируем на препарате большее число митотических фигур, когда же митоз идет быстрее, то и фигур меньше.
Для выяснения истинного соотношения уровня митотической активности и длительности митоза мы использовали колхамин, который блокирует деление клеток на стадии метафазы. Оказалось, что максимальное накопление К-митозов (метафазных фигур) в карциноме приходилось на период от 10 до 18 ч, а минимальное - от 18 до 02 ч. В контрольной группе (без обработки колхамином) получены аналогичные результаты. Применив известную формулу для определения продолжительности митоза, мы нашли, что время митоза изменяется на протяжении суток, причем наибольшая продолжительность (4,3 ч отмечена в период 18-22 ч, а наименьшая (2,5-2,7 ч)-в период 06-10-14 ч. Следовательно, в часы, когда большая часть клеточной популяции опухоли вступает в митоз, время последнего минимально, а в часы, когда делящихся клеток мало, - максимально. Из полученных данных был сделан вывод о том, что, хотя на протяжении суток изменяется продолжительность митоза, число митотических фигур, регистрируемых как при применении колхамина, так и без него, отражает истинное увеличение или уменьшение количества делящихся клеток, т. е. уровень митотической активности в опухоли в разные часы суток. Представление о том, что различная длительность митоза не изменяет общего характера суточной периодичности делящихся клеток, подтвердилось в исследованиях, проведенных на нормальных тканях.
Вместе с тем колхициновый метод позволил получить весьма интересные сведения о характере пролиферативных процессов в опухоли. Поскольку в 4-часовой период (18-22 ч) митоз длится 4, 3 ч, можно полагать, что величина митотического индекса в эти часы суток отражает не столько число клеток, вступающих в митоз, сколько число клеток, уже находящихся в митозе в этот период времени. Другими словами, ничто не исключает того, что рост опухоли происходит за счет выхода клеток в митоз именно в утренние и дневные часы суток, когда увеличиваются и скорость митоза, и число митотических фигур, а в ночные часы опухоль практически не растет. Здесь и заложен первый вариант хронобиологического подхода, ставящего своей целью повысить эффективность химиотерапевтических средств. С этой целью для применения противоопухолевого препарата необходимо выбрать такое время суток, когда большая часть клеток карциномы находится в фазе митотического цикла, наиболее чувствительной к данному препарату.
Мы использовали циклофосфан, а так как наиболее чувствительной к его средним дозам (50 мг/кг) является G2-фаза, то препарат вводили внутрибрюшинно 1-й группе мышей в 05 ч (учитывая, что продолжительность G2-фазы в карциноме преджелудка составляет в среднем 27г ч, мы тем самым старались повлиять на клетки, которые «обеспечивают» утренний и дневной максимум митотической активности), а 2-й группе - в 17 ч (т. е. влияя на те клетки G2-фазы, которые затем «обусловливают» минимум митозов, полагая, что утром клеток в премитотической фазе значительно больше, чем вечером). После и утренней, и вечерней инъекций циклофосфана уровень митотической активности в карциноме преджелудка достоверно снижался по Сравнению с таковым в карциноме нелеченых животных. Среднесуточный митотический коэффициент (МК) в контроле составлял 13,2%0; после 5-часового введения препарата - 7,8%о; после 17-часового - 8,6%; однако наиболее значимыми с хронобиологической точки зрения явились различия в степени угнетения клеточной пролиферации после утренней и вечерней инъекций, в часы ее максимального ингибирования - в 07; 10 и 13 ч. После утреннего введения циклофосфана наибольшая степень снижения МК приходилась на 07 ч (2,5 раза), 10 ч (2,7 раза) и 13 ч (2,2 раза) с максимумом угнетения митотической активности через 5 ч после инъекции (в 10 ч). После вечернего введения препарата наибольшая степень снижения МК приходилась на те же часы суток, но она была менее выражена (соответственно в 1,6; 1,9 и 1,5 раза) с максимумом угнетения через 17 ч после инъекции (то же в 10 ч). Различия между МК в 07; 10 и 13 ч после утреннего и вечернего введения препарата достоверны.
Полученные данные показывают, что при введении противоопухолевого препарата (циклофосфана) в разные часы суток, во-первых, максимальное ингибирование клеточной пролиферации в карциноме преджелудка наступает через разное время после инъекций, а, во-вторых, степень угнетения митотической активности в эти часы суток также различна.
С целью выяснения, каким образом различия в степени ингибирования митозов в часы наибольшего угнетения размножения клеток в опухоли могут повлиять на темп ее роста, был проведен дополнительный опыт. Мышам 1-й группы (20 животных) циклофосфан вводили 4 дня подряд в 05 ч (каждый день по 50 мг/кг), 2-й - в 17 ч, 3-я группа служила контролем. Оказалось, что у нелеченых животных средняя масса карциномы преджелудка составила 4,2 г, после вечерней инъекции - 3,6 г, а после утренней -3,1 г. Степень торможения роста опухоли после 5-часового введения циклофосфана (26,2%) была почти в 2 раза выше, чем после вечернего (13,9%).
Результатом чего же является столь значительное увеличение эффективности циклофосфана утром, если принять во внимание, что различия между среднесуточными значениями митотических коэффициентов после утреннего и вечернего введения (соответственно 7,8 и 8,6%0) недостоверны? Большое значение в объяснении этого феномена имеют данные, полученные при использовании колхамина. Как было отмечено выше, в 18-22 ч при значительной длительности митоза (4,3 ч) и низком уровне митотической активности при обычном подсчете регистрировались в основном те клетки, которые уже находятся в фазе деления, тогда как в утренние и дневные часы митотические коэффициенты в большей степени отражали число клеток, вступающих в митоз. Следовательно, введение циклофосфана в 05 ч блокирует в С2-фазе клеточную популяцию, за счет которой и происходит в основном рост опухоли. Этим и объясняется то, что, хотя различие в степени ингибирования клеточной пролиферации после утренней и вечерней инъекций циклофосфана при обычном подсчете митозов отмечено лишь в утренние и дневные часы, цитостатическое действие препарата на темп роста опухоли различается в 2 раза. Другими словами, полученные данные подтверждают представление о синхронности прохождения клетками различных фаз митотического цикла не только в нормальных тканях, но и в опухолях. Кроме того, эти результаты свидетельствуют в пользу того мнения, что наиболее чувствительными к средним дозам циклофосфана являются клетки, находящиеся в премитотической фазе, на которые он и оказывает свое преимущественное воздействие, блокируя переход из С2-фазы в фазу митоза.. Поскольку в литературе накоплены сведения о том, какие фазы митотического цикла наиболее чувствительны к различным противоопухолевым препаратам, хронобиологический подход представляется весьма перспективным.
Необходимо отметить, что предпринимались попытки использовать не только естественную ритмичность процессов клеточного размножения в опухолях, но и при помощи различных веществ (цАМФ, винкристин) синхронизировать клеточную кинетику в злокачественных новообразованиях при раке груди с тем, чтобы, увеличив популяцию клеток в определенной фазе митотического цикла, затем воздействовать цитостатическим препаратом, обладающим преимущественным действием на данную фазу, и тем самым повысить эффективность химиотерапевтического лечения.
Максимальное число делящихся клеток в опухоли (20,6%) в 10 ч превосходит минимальное (8,5%) в 01 ч в 2,4 раза. Обращает на себя внимание и то, что среднесуточный уровень митозов (13,2%) в карциноме в 3,6 раза выше, чем в нормальном преджелудке (3,7%о), что на первый взгляд свидетельствует о более высокой пролиферативной активности в опухоли. Вместе с тем в литературе встречались сообщения о том, что на протяжении суток изменяется не только число клеток, вступающих в деление, но и длительность самого митоза. В связи с этим делался вывод о том, что определяемая митотическая активность есть не что иное, как отражение длительности митоза. В часы суток, когда время течения митоза больше, мы и регистрируем на препарате большее число митотических фигур, когда же митоз идет быстрее, то и фигур меньше.
Для выяснения истинного соотношения уровня митотической активности и длительности митоза мы использовали колхамин, который блокирует деление клеток на стадии метафазы. Оказалось, что максимальное накопление К-митозов (метафазных фигур) в карциноме приходилось на период от 10 до 18 ч, а минимальное - от 18 до 02 ч. В контрольной группе (без обработки колхамином) получены аналогичные результаты. Применив известную формулу для определения продолжительности митоза, мы нашли, что время митоза изменяется на протяжении суток, причем наибольшая продолжительность (4,3 ч отмечена в период 18-22 ч, а наименьшая (2,5-2,7 ч)-в период 06-10-14 ч. Следовательно, в часы, когда большая часть клеточной популяции опухоли вступает в митоз, время последнего минимально, а в часы, когда делящихся клеток мало, - максимально. Из полученных данных был сделан вывод о том, что, хотя на протяжении суток изменяется продолжительность митоза, число митотических фигур, регистрируемых как при применении колхамина, так и без него, отражает истинное увеличение или уменьшение количества делящихся клеток, т. е. уровень митотической активности в опухоли в разные часы суток. Представление о том, что различная длительность митоза не изменяет общего характера суточной периодичности делящихся клеток, подтвердилось в исследованиях, проведенных на нормальных тканях.
Вместе с тем колхициновый метод позволил получить весьма интересные сведения о характере пролиферативных процессов в опухоли. Поскольку в 4-часовой период (18-22 ч) митоз длится 4, 3 ч, можно полагать, что величина митотического индекса в эти часы суток отражает не столько число клеток, вступающих в митоз, сколько число клеток, уже находящихся в митозе в этот период времени. Другими словами, ничто не исключает того, что рост опухоли происходит за счет выхода клеток в митоз именно в утренние и дневные часы суток, когда увеличиваются и скорость митоза, и число митотических фигур, а в ночные часы опухоль практически не растет. Здесь и заложен первый вариант хронобиологического подхода, ставящего своей целью повысить эффективность химиотерапевтических средств. С этой целью для применения противоопухолевого препарата необходимо выбрать такое время суток, когда большая часть клеток карциномы находится в фазе митотического цикла, наиболее чувствительной к данному препарату.
Мы использовали циклофосфан, а так как наиболее чувствительной к его средним дозам (50 мг/кг) является G2-фаза, то препарат вводили внутрибрюшинно 1-й группе мышей в 05 ч (учитывая, что продолжительность G2-фазы в карциноме преджелудка составляет в среднем 27г ч, мы тем самым старались повлиять на клетки, которые «обеспечивают» утренний и дневной максимум митотической активности), а 2-й группе - в 17 ч (т. е. влияя на те клетки G2-фазы, которые затем «обусловливают» минимум митозов, полагая, что утром клеток в премитотической фазе значительно больше, чем вечером). После и утренней, и вечерней инъекций циклофосфана уровень митотической активности в карциноме преджелудка достоверно снижался по Сравнению с таковым в карциноме нелеченых животных. Среднесуточный митотический коэффициент (МК) в контроле составлял 13,2%0; после 5-часового введения препарата - 7,8%о; после 17-часового - 8,6%; однако наиболее значимыми с хронобиологической точки зрения явились различия в степени угнетения клеточной пролиферации после утренней и вечерней инъекций, в часы ее максимального ингибирования - в 07; 10 и 13 ч. После утреннего введения циклофосфана наибольшая степень снижения МК приходилась на 07 ч (2,5 раза), 10 ч (2,7 раза) и 13 ч (2,2 раза) с максимумом угнетения митотической активности через 5 ч после инъекции (в 10 ч). После вечернего введения препарата наибольшая степень снижения МК приходилась на те же часы суток, но она была менее выражена (соответственно в 1,6; 1,9 и 1,5 раза) с максимумом угнетения через 17 ч после инъекции (то же в 10 ч). Различия между МК в 07; 10 и 13 ч после утреннего и вечернего введения препарата достоверны.
Полученные данные показывают, что при введении противоопухолевого препарата (циклофосфана) в разные часы суток, во-первых, максимальное ингибирование клеточной пролиферации в карциноме преджелудка наступает через разное время после инъекций, а, во-вторых, степень угнетения митотической активности в эти часы суток также различна.
С целью выяснения, каким образом различия в степени ингибирования митозов в часы наибольшего угнетения размножения клеток в опухоли могут повлиять на темп ее роста, был проведен дополнительный опыт. Мышам 1-й группы (20 животных) циклофосфан вводили 4 дня подряд в 05 ч (каждый день по 50 мг/кг), 2-й - в 17 ч, 3-я группа служила контролем. Оказалось, что у нелеченых животных средняя масса карциномы преджелудка составила 4,2 г, после вечерней инъекции - 3,6 г, а после утренней -3,1 г. Степень торможения роста опухоли после 5-часового введения циклофосфана (26,2%) была почти в 2 раза выше, чем после вечернего (13,9%).
Результатом чего же является столь значительное увеличение эффективности циклофосфана утром, если принять во внимание, что различия между среднесуточными значениями митотических коэффициентов после утреннего и вечернего введения (соответственно 7,8 и 8,6%0) недостоверны? Большое значение в объяснении этого феномена имеют данные, полученные при использовании колхамина. Как было отмечено выше, в 18-22 ч при значительной длительности митоза (4,3 ч) и низком уровне митотической активности при обычном подсчете регистрировались в основном те клетки, которые уже находятся в фазе деления, тогда как в утренние и дневные часы митотические коэффициенты в большей степени отражали число клеток, вступающих в митоз. Следовательно, введение циклофосфана в 05 ч блокирует в С2-фазе клеточную популяцию, за счет которой и происходит в основном рост опухоли. Этим и объясняется то, что, хотя различие в степени ингибирования клеточной пролиферации после утренней и вечерней инъекций циклофосфана при обычном подсчете митозов отмечено лишь в утренние и дневные часы, цитостатическое действие препарата на темп роста опухоли различается в 2 раза. Другими словами, полученные данные подтверждают представление о синхронности прохождения клетками различных фаз митотического цикла не только в нормальных тканях, но и в опухолях. Кроме того, эти результаты свидетельствуют в пользу того мнения, что наиболее чувствительными к средним дозам циклофосфана являются клетки, находящиеся в премитотической фазе, на которые он и оказывает свое преимущественное воздействие, блокируя переход из С2-фазы в фазу митоза.. Поскольку в литературе накоплены сведения о том, какие фазы митотического цикла наиболее чувствительны к различным противоопухолевым препаратам, хронобиологический подход представляется весьма перспективным.
Необходимо отметить, что предпринимались попытки использовать не только естественную ритмичность процессов клеточного размножения в опухолях, но и при помощи различных веществ (цАМФ, винкристин) синхронизировать клеточную кинетику в злокачественных новообразованиях при раке груди с тем, чтобы, увеличив популяцию клеток в определенной фазе митотического цикла, затем воздействовать цитостатическим препаратом, обладающим преимущественным действием на данную фазу, и тем самым повысить эффективность химиотерапевтического лечения.