Латентное носительство бактериофага гемолитическими стрептококками группы А
Вопросам латентного носительства бактериальных вирусов и изучению умеренных бактериофагов уделяется большое внимание, главным образом в связи с разработкой ряда общебиологических проблем на модели лизогенных микробов. Лизогении у гемолитических стрептококков группы А посвящен ряд работ зарубежных авторов было показано, что среди музейных культур гемолитических стрептококков лизогенные штаммы встречались в 50%, причем наиболее эффективным средством их обнаружения оказался метод индукции ультрафиолетовыми лучами. Перед настоящей работой была поставлена цель изучить лизогенные свойства стрептококковых культур, выделенных от больных, получить набор фагов, проверить возможность дифференцировки культур по их отношению к фагам и попытаться установить параллели между вирулентностью культур и их чувствительностью к вирулентному и умеренным бактериофагам.
Микробные культуры. В работе была использована 171 культура гемолитического стрептококка группы А, из них 112 штаммов выделены от детей, больных скарлатиной, 29 - от носителей стрептококка в детских коллективах и 30 - относились к коллекции типового стрептококкового музея, полученного из Праги.
Бактериофаги. В опытах использовалось 18 умеренных фагов, выделенных из лизогенных культур, а также вирулентный фаг СА I.
Фаги были выделены из культур методом индукции ультрафиолетовыми лучами: 3-часовую культуру стрептококка на 5%-ном сывороточном бульоне, разводили вероналовым буфером рН = 7,4-7,6 в соотношении 1 : 20-1 : 30, распределяли тонким слоем в количестве 5-6 мл по дну чашки Петри и облучали бактерицидной лампой БУВ-30 на расстоянии 35 см от поверхности чашки в течение 30-60 сек, затем микробную взвесь вновь инкубировали в 5%-ном сывороточном бульоне в течение 2-3 ч при 37° и испытывали на присутствие фага.
Методы по испытанию, пассированию и титрованию фагов приведены в предыдущих работах. Получение антифаговых сывороток и изучение серологических свойств фагов в опытах перекрестной нейтрализации выполняли по Адамсу.
Для изучения вирулентных свойств культур и их пассирования использовали белых мышей весом 12-14 г, которым взвесь микробов вводили в объеме 0,5 мл внутрибрюшинно.
Изучение лизогении у стрептококков было выполнено на 171 культуре. 37 из них были использованы также в качестве детекторных. Испытание одной культуры на лизогению на одной детекторной культуре было условно названо нами парным сочетанием и служило единицей подсчета при учете результатов опытов. Всего было испытано 5242 сочетания, что составило около 1/6 части от общего числа возможных сочетаний. При этом было выявлено 75 лизогенных культур (43,9% к числу исследованных культур); из них среди культур от больных - 60 (53,6%), среди культур от носителей - 9 и среди музейных культур - 6.
Лизогенный признак являлся стойким и, как правило, воспроизводился при повторных исследованиях. Штаммы, выделенные от одного и того же больного, были однородны по признаку лизогенности, что было показано при испытании 60 штаммов, выделенных от 12 больных (по 5 от каждого больного).
По ходу опытов был выявлен штамм IH, высокочувствительный ко многим из фагов. Он был использован при изучении 18 выделенных фагов, которые оказались близкими по спектру литической активности и родственными серологическими по данным опытов перекрестной нейтрализации, отличаясь в то же время по этим двум признакам от вирулентного фага CAI.
При изучении диапазона действия фагов на всех испытанных культурах установлено, что из 111 культур от больных были чувствительны к вирулентному фагу 45, из 29 культур от носителей - 18, а из 30 музейных культур - 5. Диапазон действия этого фага был ограничен лишь стрептококками группы А, но при этом чувствительные к нему культуры относились к разным серологическим типам. Лизогенные культуры были обнаружены как среди чувствительных, так и резистентных штаммов с одинаковой частотой, т. е. чувствительность к вирулентному фагу не определялась лизогенными свойствами культур. К умеренным фагам были чувствительны 18 культур от больных; 8 из них были лизогенными, но это свойство выявлялось у них, в отличие от остальных лизогенных культур, не на индикаторном штамме IH. Очевидно, что они содержали фаги, отличающиеся по диапазону действия от выделенных ранее. Аналогичная картина наблюдалась и в отношении культур от носителей. В этой группе фагочувствительными оказались 12 культур, причем 6 из них были лизогенными и выделяли фаг, отличающийся по диапазону действия. Остальные лизогенные культуры, выделявшие фаги против штамма IH, были фагорезистентными. Из музейных культур к умеренным фагам были чувствительны лишь 6.
В последующих опытах была сделана попытка найти связь между вирулентностью культур и их отношением к вирулентному и умеренным фагам. При сравнительном изучении вирулентности на мышах лизогенных и нелизогенных культур не удалось обнаружить между ними существенных различий.
В дополнение к нашим данным удалось показать широкое распространение носительства латентных фагов как среди музейных культур, так и среди культур, выделенных от больных. В обоих случаях процент выявленных лизогенных культур был близок к 50. Аналогичные цифры приводятся в литературе авторами, которые преимущественно применяли один детекторный штамм, а потому рассматривают приведенный показатель как минимальный. В настоящей же работе было использовано в качестве детекторов 37 штаммов при большом числе разных сочетаний. И хотя испытанное число сочетаний не исчерпывает все возможные, мы полагаем, что установленный процент лизогении близок к действительному.
Диапазон действия вирулентного и умеренных стрептококковых фагов не зависел в наших опытах от серологического типа исследуемых культур. Спектр действия умеренных фагов определялся в первую очередь лизогенными свойствами культур. Видимо, с этим связано то обстоятельство, что все фаги, выделенные на индикаторном штамме IH, были близки по диапазону действия и родственные по своей серологической характеристике. Этим еще раз подчеркивается ценность обоих показателей в качестве таксономических признаков для классификации стрептококковых фагов, на что было обращено внимание в одной из предыдущих работ.
При сравнительном изучении исходной вирулентности лизогенных и нелизогенных культур не было обнаружено влияние профага на данный признак. Но пассирование культур на мышах привело к повышению их вирулентности с одновременным усилением продукции носимого фага и потерей чувствительности к фагам (в том числе и к вирулентному, к которому две исходные культуры были чувствительны). Последнее может быть связано с изменением поверхности микробных клеток, препятствующих адсорбции фагов, а усиление лизогенизации - с селекцией линий клеток, наиболее чувствительных к индуцирующему действию ультрафиолетовых лучей.
На основании проведенных исследований можно сделать следующие выводы:
1. Лизогения широко распространена среди лабораторных и выделенных от больных скарлатиной культур гемолитического стрептококка. Изучение лизогенных свойств штаммов путем перекрестного их испытания в большом числе сочетаний является эффективным средством выявления большого числа лизогенных культур.
2. Выделено и исследовано 18 умеренных фагов, родственных по серологическим свойствам и по диапазону действия. Фаги не специфичны в отношении культур разных серотипов группы А, спектр их литического действия определяется лизогенными свойствами культур.
3. Лизогенные и нелизогенные культуры стрептококка не отличаются друг от друга по вирулентности. Пассирование лизогенных культур на мышах привело к повышению их вирулентности и сопровождалось потерей чувствительности к фагам с одновременным усилением продукции носимого бактериофага.
Микробные культуры. В работе была использована 171 культура гемолитического стрептококка группы А, из них 112 штаммов выделены от детей, больных скарлатиной, 29 - от носителей стрептококка в детских коллективах и 30 - относились к коллекции типового стрептококкового музея, полученного из Праги.
Бактериофаги. В опытах использовалось 18 умеренных фагов, выделенных из лизогенных культур, а также вирулентный фаг СА I.
Фаги были выделены из культур методом индукции ультрафиолетовыми лучами: 3-часовую культуру стрептококка на 5%-ном сывороточном бульоне, разводили вероналовым буфером рН = 7,4-7,6 в соотношении 1 : 20-1 : 30, распределяли тонким слоем в количестве 5-6 мл по дну чашки Петри и облучали бактерицидной лампой БУВ-30 на расстоянии 35 см от поверхности чашки в течение 30-60 сек, затем микробную взвесь вновь инкубировали в 5%-ном сывороточном бульоне в течение 2-3 ч при 37° и испытывали на присутствие фага.
Методы по испытанию, пассированию и титрованию фагов приведены в предыдущих работах. Получение антифаговых сывороток и изучение серологических свойств фагов в опытах перекрестной нейтрализации выполняли по Адамсу.
Для изучения вирулентных свойств культур и их пассирования использовали белых мышей весом 12-14 г, которым взвесь микробов вводили в объеме 0,5 мл внутрибрюшинно.
Изучение лизогении у стрептококков было выполнено на 171 культуре. 37 из них были использованы также в качестве детекторных. Испытание одной культуры на лизогению на одной детекторной культуре было условно названо нами парным сочетанием и служило единицей подсчета при учете результатов опытов. Всего было испытано 5242 сочетания, что составило около 1/6 части от общего числа возможных сочетаний. При этом было выявлено 75 лизогенных культур (43,9% к числу исследованных культур); из них среди культур от больных - 60 (53,6%), среди культур от носителей - 9 и среди музейных культур - 6.
Лизогенный признак являлся стойким и, как правило, воспроизводился при повторных исследованиях. Штаммы, выделенные от одного и того же больного, были однородны по признаку лизогенности, что было показано при испытании 60 штаммов, выделенных от 12 больных (по 5 от каждого больного).
По ходу опытов был выявлен штамм IH, высокочувствительный ко многим из фагов. Он был использован при изучении 18 выделенных фагов, которые оказались близкими по спектру литической активности и родственными серологическими по данным опытов перекрестной нейтрализации, отличаясь в то же время по этим двум признакам от вирулентного фага CAI.
При изучении диапазона действия фагов на всех испытанных культурах установлено, что из 111 культур от больных были чувствительны к вирулентному фагу 45, из 29 культур от носителей - 18, а из 30 музейных культур - 5. Диапазон действия этого фага был ограничен лишь стрептококками группы А, но при этом чувствительные к нему культуры относились к разным серологическим типам. Лизогенные культуры были обнаружены как среди чувствительных, так и резистентных штаммов с одинаковой частотой, т. е. чувствительность к вирулентному фагу не определялась лизогенными свойствами культур. К умеренным фагам были чувствительны 18 культур от больных; 8 из них были лизогенными, но это свойство выявлялось у них, в отличие от остальных лизогенных культур, не на индикаторном штамме IH. Очевидно, что они содержали фаги, отличающиеся по диапазону действия от выделенных ранее. Аналогичная картина наблюдалась и в отношении культур от носителей. В этой группе фагочувствительными оказались 12 культур, причем 6 из них были лизогенными и выделяли фаг, отличающийся по диапазону действия. Остальные лизогенные культуры, выделявшие фаги против штамма IH, были фагорезистентными. Из музейных культур к умеренным фагам были чувствительны лишь 6.
В последующих опытах была сделана попытка найти связь между вирулентностью культур и их отношением к вирулентному и умеренным фагам. При сравнительном изучении вирулентности на мышах лизогенных и нелизогенных культур не удалось обнаружить между ними существенных различий.
В дополнение к нашим данным удалось показать широкое распространение носительства латентных фагов как среди музейных культур, так и среди культур, выделенных от больных. В обоих случаях процент выявленных лизогенных культур был близок к 50. Аналогичные цифры приводятся в литературе авторами, которые преимущественно применяли один детекторный штамм, а потому рассматривают приведенный показатель как минимальный. В настоящей же работе было использовано в качестве детекторов 37 штаммов при большом числе разных сочетаний. И хотя испытанное число сочетаний не исчерпывает все возможные, мы полагаем, что установленный процент лизогении близок к действительному.
Диапазон действия вирулентного и умеренных стрептококковых фагов не зависел в наших опытах от серологического типа исследуемых культур. Спектр действия умеренных фагов определялся в первую очередь лизогенными свойствами культур. Видимо, с этим связано то обстоятельство, что все фаги, выделенные на индикаторном штамме IH, были близки по диапазону действия и родственные по своей серологической характеристике. Этим еще раз подчеркивается ценность обоих показателей в качестве таксономических признаков для классификации стрептококковых фагов, на что было обращено внимание в одной из предыдущих работ.
При сравнительном изучении исходной вирулентности лизогенных и нелизогенных культур не было обнаружено влияние профага на данный признак. Но пассирование культур на мышах привело к повышению их вирулентности с одновременным усилением продукции носимого фага и потерей чувствительности к фагам (в том числе и к вирулентному, к которому две исходные культуры были чувствительны). Последнее может быть связано с изменением поверхности микробных клеток, препятствующих адсорбции фагов, а усиление лизогенизации - с селекцией линий клеток, наиболее чувствительных к индуцирующему действию ультрафиолетовых лучей.
На основании проведенных исследований можно сделать следующие выводы:
1. Лизогения широко распространена среди лабораторных и выделенных от больных скарлатиной культур гемолитического стрептококка. Изучение лизогенных свойств штаммов путем перекрестного их испытания в большом числе сочетаний является эффективным средством выявления большого числа лизогенных культур.
2. Выделено и исследовано 18 умеренных фагов, родственных по серологическим свойствам и по диапазону действия. Фаги не специфичны в отношении культур разных серотипов группы А, спектр их литического действия определяется лизогенными свойствами культур.
3. Лизогенные и нелизогенные культуры стрептококка не отличаются друг от друга по вирулентности. Пассирование лизогенных культур на мышах привело к повышению их вирулентности и сопровождалось потерей чувствительности к фагам с одновременным усилением продукции носимого бактериофага.