О факторе, вызывающем а-гемолиз, и его биологическом действии
Для изучения фактора, вызывающего а-гемолиз, представлялось целесообразным использовать центрифугаты (или фильтраты) соответствующих культур, выращенных на бескровных жидких средах, если допустить, что речь идет об агенте, выделяемом в культуральную жидкость, как это имеет место, например, в отношении О-гемолизина. Мы добавляли к 0,5 мл взвеси бараньих эритроцитов, содержащих 15 г% гемоглобина, равный объем центрифугата 18-часовых культур зеленящих стрептококков в сахарном бульоне и учитывали изменения эритроцитов после 20-минутной инкубации при 37°. В этих условиях из 196 культур (от больных хроническим тонзиллитом и от здоровых лиц) вызывали позеленение эритроцитарного осадка 78 культур (40%); более чем в половине исследований концентрация зеленящего агента оказалась недостаточной для визуальных изменений. При микроскопическом исследовании (фазовый контраст) можно было наблюдать изменения эритроцитов в виде многочисленных вдавлений на поверхности клетки. Следует отметить, что почти треть положительных центрифугатов (30 из 78) вызывала наряду с позеленением также более или менее выраженный гемолиз Это следовало отнести, по-видимому, за счет продуцирования указанными культурами некоторого количества О-стрептолизина. Действительно, гемолиз сохранялся при добавлении к испытуемой жидкости 1% сульфита натрия, что снимало позеленение. Исследование продукции зеленящего фактора в процессе размножения культур зеленящих стрептококков показало, что он обнаруживался в культуральной жидкости спустя 4 ч от начала инкубации и достигал максимальной концентрации через 10 ч, когда культура находилась в максимальной стационарной фазе. В дальнейшем, с уменьшением числа жизнеспособных клеток в культуре понижалась и способность центрифугатов вызывать позеленение эритроцитов. Эта параллельная динамика обеих кривых давала основание считать, что продукция зеленящего фактора связана с жизнедеятельностью стрептококков. Следует отметить, что накопление агента способствовало выращиванию культур в тонком слое. Это свойство дифференцировало в свою очередь зеленящий фактор от наиболее активных в анаэробных условиях стрептококковых гемолизинов.
Опыты по изучению физико-химических свойств зеленящего фактора показали, что он относится к низкомолекулярным веществам. Так, фактор проходил через целлофан, не осаждался сернокислым аммонием, экстрагировался ацетоном и этанолом и не инактивировался при кипячении. Эти свойства были положены в основу методики выделения зеленящего фактора из культуральной жидкости. К центрифугату бульонной культуры добавляли сернокислый аммоний в количестве 750 г/л и по выдерживании в течение 18 ч при 4° отфильтровывали от выпавшего осадка безбелковую жидкость, к которой добавляли ацетон в соотношении 1 : 6 и смесь встряхивали. После расслоения смеси на две фазы отсасывали ацетоновый слой, ацетон отгоняли, а оставшуюся жидкость упаривали досуха. Полученный материал экстрагировался в количестве 20 мл/г 96 процентным этанолом, после чего этанол отгоняли, сухой остаток растворяли в небольшом количестве дистиллированной воды и диализовали против дистиллированной воды. При этом зеленящий фактор проходил во внешнюю диализующую жидкость, которая собиралась и упаривалась до небольшого объема.
В полученных препаратах определяли содержание агента путем испытания разных разведений. За условную единицу было принято то минимальное количество, которое в объеме 0,5 мл давало в течение 30 мин при 37° полное позеленение 0,5 мл взвеси эритроцитов барана, содержащей 5 г% гемоглобина. Титры препаратов колебались - в зависимости от содержания фактора в исходной культуральной жидкости - в широких пределах: от 30 ед./жл до нескольких сотен и даже более 1000 ед./жл. Следует отметить, что и из незасеянных питательных сред (бульон Коникова, сахарный бульон, 10%-ная мясная вода с глюкозой) можно было извлечь по указанной методике вещества, которые также вызывали изменение цвета эритроцитов. Однако их содержание было низким и ни разу не превышало 40 ед./жл, а чаще - было ниже.
Для получения препаратов, вызывающих позеленение эритроцитов, отбирались культуры, центрифугаты которых не вызывали видимого гемолиза. Тем не менее, некоторые препараты при добавлении в концентрированном виде к взвеси эритроцитов разрушали последние с одновременным изменением гемоглобина, выпадавшего в осадок. При последовательном уменьшении концентрации препаратов уменьшался сначала выпадавший осадок, далее отмечался распад эритроцитов с изменением цвета гемоглобина в отсутствие осадка; еще более разведенные препараты вызывали изменение цвета эритроцитов без их разрушения.
Биологическое действие препаратов зеленящего фактора было изучено в опытах на белых мышах, которым вводили в вену их разные дозы. Из 5 контрольных препаратов, приготовленных из незасеянной питательной среды, 4 препарата вызывали гибель животных в дозе 0,5 мл и лишь один - в дозе 0,33 мл. Из 15 препаратов, т. е. приготовленных из культуральной жидкости разных зеленящих стрептококков, у 7 токсическая смертельная доза равнялась 0,5 мл и еще у 4 - 0,33 мл. Все эти препараты отличались низким содержанием зеленящего фактора - от 30 до 90 ел./мл. Титр остальных 4 препаратов колебался от 340 до 1500 ел/1мл. Они вызывали гибель мышей в дозах 0,25-0,06 мл. В этих случаях токсическое действие следовало отнести, по-видимому, за счет зеленящего фактора; летальная доза была в пределах 85-150 ед.
Представлялось показанным исследовать действие зеленящего фактора на деятельность изолированного сердца по аналогии с такими исследованиями в отношении О-стрептолизина. Опыты ставились в основном на сердце лягушки и частично на сердце кролика. Сердце лягушки изолировалось по методике Штрауба. Испытуемые препараты в разных разведениях в объеме 0,1 мл вводили в канюлю, на которой укреплялось сердце. Каждая доза испытывалась на нескольких препаратах сердца, запись сокращений которого производилась обычным способом. В опытах на сердце кролика применялся, как обычно, подогретый до 38° и обогащенный кислородом раствор Рингера-Локка; исследуемые препараты вводили путем прокола резиновой соединительной трубки в разных разведениях в объеме 0,5 мл. И в этих опытах каждая доза испытывалась на 2-3 сердечных препаратах.
Из 6 исследованных контрольных препаратов, приготовленных из незасеянной питательной среды, 4 препарата оказались активными на сердце лягушки в дозе 0,1 мл, два другие - в дозах 0,05-0,033 мл. Действие препаратов проявлялось в быстро наступавшей остановке сердца во время диастолы. При снижении доз до 0,02 мл и меньше могло отмечаться преходящее снижение амплитуды сокращений сердца. Описанное действие контрольных препаратов следовало, по-видимому, рассматривать как неспецифическое, т. е. не связанное с зеленящим фактором. Действительно, то же самое отмечалось в опытах с 8 испытуемыми препаратами, из которых два оказались активными лишь в дозе 0,1 мл, у 5 эффективная доза равнялась 0,05 мл и у одного - 0,033 мл
Как указывалось выше, зеленящий фактор представлялся низкомолекулярным веществом. Вряд ли поэтому можно было ожидать, что он может обладать антигенными свойствами. Действительно, иммунизация кроликов полученными препаратами дала отрицательный результат: их сыворотки не нейтрализовали фактор и не реагировали с ним в опытах in vitro. Такой же результат был получен в опытах с сыворотками кроликов, иммунизированных микробной взвесью соответствующих культур: сыворотки не реагировали с зеленящим фактором и не нейтрализовали его кардиотоксическое действие.
Опыты по изучению физико-химических свойств зеленящего фактора показали, что он относится к низкомолекулярным веществам. Так, фактор проходил через целлофан, не осаждался сернокислым аммонием, экстрагировался ацетоном и этанолом и не инактивировался при кипячении. Эти свойства были положены в основу методики выделения зеленящего фактора из культуральной жидкости. К центрифугату бульонной культуры добавляли сернокислый аммоний в количестве 750 г/л и по выдерживании в течение 18 ч при 4° отфильтровывали от выпавшего осадка безбелковую жидкость, к которой добавляли ацетон в соотношении 1 : 6 и смесь встряхивали. После расслоения смеси на две фазы отсасывали ацетоновый слой, ацетон отгоняли, а оставшуюся жидкость упаривали досуха. Полученный материал экстрагировался в количестве 20 мл/г 96 процентным этанолом, после чего этанол отгоняли, сухой остаток растворяли в небольшом количестве дистиллированной воды и диализовали против дистиллированной воды. При этом зеленящий фактор проходил во внешнюю диализующую жидкость, которая собиралась и упаривалась до небольшого объема.
В полученных препаратах определяли содержание агента путем испытания разных разведений. За условную единицу было принято то минимальное количество, которое в объеме 0,5 мл давало в течение 30 мин при 37° полное позеленение 0,5 мл взвеси эритроцитов барана, содержащей 5 г% гемоглобина. Титры препаратов колебались - в зависимости от содержания фактора в исходной культуральной жидкости - в широких пределах: от 30 ед./жл до нескольких сотен и даже более 1000 ед./жл. Следует отметить, что и из незасеянных питательных сред (бульон Коникова, сахарный бульон, 10%-ная мясная вода с глюкозой) можно было извлечь по указанной методике вещества, которые также вызывали изменение цвета эритроцитов. Однако их содержание было низким и ни разу не превышало 40 ед./жл, а чаще - было ниже.
Для получения препаратов, вызывающих позеленение эритроцитов, отбирались культуры, центрифугаты которых не вызывали видимого гемолиза. Тем не менее, некоторые препараты при добавлении в концентрированном виде к взвеси эритроцитов разрушали последние с одновременным изменением гемоглобина, выпадавшего в осадок. При последовательном уменьшении концентрации препаратов уменьшался сначала выпадавший осадок, далее отмечался распад эритроцитов с изменением цвета гемоглобина в отсутствие осадка; еще более разведенные препараты вызывали изменение цвета эритроцитов без их разрушения.
Биологическое действие препаратов зеленящего фактора было изучено в опытах на белых мышах, которым вводили в вену их разные дозы. Из 5 контрольных препаратов, приготовленных из незасеянной питательной среды, 4 препарата вызывали гибель животных в дозе 0,5 мл и лишь один - в дозе 0,33 мл. Из 15 препаратов, т. е. приготовленных из культуральной жидкости разных зеленящих стрептококков, у 7 токсическая смертельная доза равнялась 0,5 мл и еще у 4 - 0,33 мл. Все эти препараты отличались низким содержанием зеленящего фактора - от 30 до 90 ел./мл. Титр остальных 4 препаратов колебался от 340 до 1500 ел/1мл. Они вызывали гибель мышей в дозах 0,25-0,06 мл. В этих случаях токсическое действие следовало отнести, по-видимому, за счет зеленящего фактора; летальная доза была в пределах 85-150 ед.
Представлялось показанным исследовать действие зеленящего фактора на деятельность изолированного сердца по аналогии с такими исследованиями в отношении О-стрептолизина. Опыты ставились в основном на сердце лягушки и частично на сердце кролика. Сердце лягушки изолировалось по методике Штрауба. Испытуемые препараты в разных разведениях в объеме 0,1 мл вводили в канюлю, на которой укреплялось сердце. Каждая доза испытывалась на нескольких препаратах сердца, запись сокращений которого производилась обычным способом. В опытах на сердце кролика применялся, как обычно, подогретый до 38° и обогащенный кислородом раствор Рингера-Локка; исследуемые препараты вводили путем прокола резиновой соединительной трубки в разных разведениях в объеме 0,5 мл. И в этих опытах каждая доза испытывалась на 2-3 сердечных препаратах.
Из 6 исследованных контрольных препаратов, приготовленных из незасеянной питательной среды, 4 препарата оказались активными на сердце лягушки в дозе 0,1 мл, два другие - в дозах 0,05-0,033 мл. Действие препаратов проявлялось в быстро наступавшей остановке сердца во время диастолы. При снижении доз до 0,02 мл и меньше могло отмечаться преходящее снижение амплитуды сокращений сердца. Описанное действие контрольных препаратов следовало, по-видимому, рассматривать как неспецифическое, т. е. не связанное с зеленящим фактором. Действительно, то же самое отмечалось в опытах с 8 испытуемыми препаратами, из которых два оказались активными лишь в дозе 0,1 мл, у 5 эффективная доза равнялась 0,05 мл и у одного - 0,033 мл
Как указывалось выше, зеленящий фактор представлялся низкомолекулярным веществом. Вряд ли поэтому можно было ожидать, что он может обладать антигенными свойствами. Действительно, иммунизация кроликов полученными препаратами дала отрицательный результат: их сыворотки не нейтрализовали фактор и не реагировали с ним в опытах in vitro. Такой же результат был получен в опытах с сыворотками кроликов, иммунизированных микробной взвесью соответствующих культур: сыворотки не реагировали с зеленящим фактором и не нейтрализовали его кардиотоксическое действие.