Антитоксические сыворотки
Эти иммунные сыворотки относятся к числу гетерологичных препаратов, так как источником их получения являются в основном лошади. Из числа этих препаратов наиболее велик опыт применения противостолбнячной сыворотки, которую к тому же вводят в основном для профилактики столбняка. Поэтому мы сочли возможным рассмотреть принципиально идентичные особенности производства гетерологичных иммунных сывороток на основе технологической схемы получения противостолбнячной сыворотки.
Донорами или, как говорят, продуцентами этих сывороток являются лошади, которых содержат в иммунизационных клиниках, состоящих из ряда функциональных отделений. Вначале здоровых, отвечающих определенным кондициям иммунологической реактивности лошадей подвергают гипериммунизации - процедуре интенсивной подкожной вакцинации нарастающими дозами анатоксина с адъювантом, завершая при необходимости цикл прививок введением необезвреженного токсина. Для получения различных иммунных сывороток отработаны оптимальные схемы гипериммунизации. На 7-й день после окончания цикла прививок производят кровопускание. Кровь из яремной вены лошади-продуцента получают в объеме, равном 1/50 массы тела животного: так у лошади с массой тела 450 кг берут 9 л крови. (После взятия крови лошадь отдыхает две недели, затем получает очередной, более короткий цикл прививок и вновь подвергается процедуре кровопускания; в качестве продуцентов гипериммунных антитоксических сывороток лошади используются в среднем два года). Бутыль с кровью направляют в отделение технической и химической обработки сыворотки, где осуществляется ее очистка и концентрирование.
В нашей стране и в ряде зарубежных стран это проводится в основном с помощью метода, получившего название диаферм (происходит от слов диализ и ферментация, лежащих в основе технологического процесса). При этом вначале кровь обрабатывают на сепараторах для отделения эритроцитов от плазмы, затем в специальных реакторах, снабженных мешалками, сывороточные белки в плазме подвергают ферментативному гидролизу с помощью пепсина в течение 2 ч в кислой зоне рН при 22-24°С. Ферментированную плазму прогревают в течение 45 мин при 56°С в присутствии 14% сульфата аммония и фильтруют, освобождаясь при этом от денатурированных и выпавших в осадок балластных белков, не обладающих функциями антител. Иммунологически активные белки - глобулины высаливают из фильтрата путем его насыщения сульфатом аммония до концентрации последнего, равной 34% при рН 7,1; отжатый осадок ресуспендируют и очищают вначале от солей путем диализа против проточной воды в течение 48 ч, а затем от оставшихся балластных белков в их изоэлектрической точке (рН 5,2-5,6) с помощью обработки диализата хлороформом. В последующем диализат освобождают от хлороформа и денатурированного белка на сепараторах, практически уже очищенную и концентрированную сыворотку дополнительно обессоливают диализатом и стерилизуют фильтрованием. После этого для стабилизации Физических свойств и биологической активности сыворотку выдерживают в течение 3 месяцев и подвергают повторной фильтрации для освобождения от выпавших в осадок иммунологически инертных липоидосодержащих белков, разливают по ампулам и контролируют.
Следует отметить, что описанный процесс изготовления иммунных сывороток не лишен недостатков. Так, при этом утрачивается до 56-60% белка - носителя антитоксической активности, сыворотка не полностью свободна от балластных белков и остатков пепсина, методика надежной инактивации которого еще не разработана. Именно поэтому для очистки и концентрирования ряда гетерологичных сывороточных препаратов используют методику выделения их гамма-глобулиновой фракции и интенсивно разрабатывают производственную технологию получения чистых антител методами специфической сорбции из сыворотки на иммуносорбентах - специфических антигенах, фиксированных на нерастворимых носителях. Если с помощью метода диаферм-3 производятся противостолбнячная, противодифтерийная, поливалентная противогангренозная, моно- и поливалентная противоботулиническая гетерологичные сыворотки, то также гетерологичные антирабическая сыворотка и сыворотка против клещевого энцефалита производятся в виде более очищенных и концентрированных препаратов гамма-глобулина. Перед выпуском производственных серий противостолбнячной сыворотки следует контролировать:
- физические свойства (сыворотка должна быть прозрачной, без хлопьев, осадка и посторонних включений; содержание белка не должно превышать 15%; рН должен быть в пределах 6,9-7,2);
- стерильность (в посевах на различные питательные среды не должны вырастать никакие микробы);
- пирогенность (у здоровых кроликов, получивших внутривенно сыворотку из расчета 1 мл на 1 кг массы тела, температура в прямой кишке не должна повышаться более чем на 0,8°С в первые 3 ч);
- безвредность (морские свинки, получившие подкожно в оба бока по 5 мл сыворотки, должны оставаться здоровыми в течение 5 дней наблюдения);
- специфическую активность (после 20-дневной выдержки сыворотки при 37°С в опытах абсолютной защиты белых мышей, получивших сыворотку разной концентрации в смеси с опытной дозой токсина, калиброванной по международному стандарту иммунной сыворотки определяют количество международных единиц - ME - антитоксина, содержащихся в 1 мл препарата).
Если результаты контрольных исследований удовлетворяют приведенным требованиям, столбнячную сыворотку, содержащую до 1000 и более ME в 1 мл, передают для профилактики или лечения столбняка в дозах, указанных в прилагаемом наставлении.
Так же контролируют свойства других гетерологичных иммунных сывороток, и лишь методика определения их специфической активности (количество ME в 1 мл), естественно, различается. Подобно вакцинам, иммунные сыворотки хранят в сухом затемненном месте при 3-10°С.
Донорами или, как говорят, продуцентами этих сывороток являются лошади, которых содержат в иммунизационных клиниках, состоящих из ряда функциональных отделений. Вначале здоровых, отвечающих определенным кондициям иммунологической реактивности лошадей подвергают гипериммунизации - процедуре интенсивной подкожной вакцинации нарастающими дозами анатоксина с адъювантом, завершая при необходимости цикл прививок введением необезвреженного токсина. Для получения различных иммунных сывороток отработаны оптимальные схемы гипериммунизации. На 7-й день после окончания цикла прививок производят кровопускание. Кровь из яремной вены лошади-продуцента получают в объеме, равном 1/50 массы тела животного: так у лошади с массой тела 450 кг берут 9 л крови. (После взятия крови лошадь отдыхает две недели, затем получает очередной, более короткий цикл прививок и вновь подвергается процедуре кровопускания; в качестве продуцентов гипериммунных антитоксических сывороток лошади используются в среднем два года). Бутыль с кровью направляют в отделение технической и химической обработки сыворотки, где осуществляется ее очистка и концентрирование.
В нашей стране и в ряде зарубежных стран это проводится в основном с помощью метода, получившего название диаферм (происходит от слов диализ и ферментация, лежащих в основе технологического процесса). При этом вначале кровь обрабатывают на сепараторах для отделения эритроцитов от плазмы, затем в специальных реакторах, снабженных мешалками, сывороточные белки в плазме подвергают ферментативному гидролизу с помощью пепсина в течение 2 ч в кислой зоне рН при 22-24°С. Ферментированную плазму прогревают в течение 45 мин при 56°С в присутствии 14% сульфата аммония и фильтруют, освобождаясь при этом от денатурированных и выпавших в осадок балластных белков, не обладающих функциями антител. Иммунологически активные белки - глобулины высаливают из фильтрата путем его насыщения сульфатом аммония до концентрации последнего, равной 34% при рН 7,1; отжатый осадок ресуспендируют и очищают вначале от солей путем диализа против проточной воды в течение 48 ч, а затем от оставшихся балластных белков в их изоэлектрической точке (рН 5,2-5,6) с помощью обработки диализата хлороформом. В последующем диализат освобождают от хлороформа и денатурированного белка на сепараторах, практически уже очищенную и концентрированную сыворотку дополнительно обессоливают диализатом и стерилизуют фильтрованием. После этого для стабилизации Физических свойств и биологической активности сыворотку выдерживают в течение 3 месяцев и подвергают повторной фильтрации для освобождения от выпавших в осадок иммунологически инертных липоидосодержащих белков, разливают по ампулам и контролируют.
Следует отметить, что описанный процесс изготовления иммунных сывороток не лишен недостатков. Так, при этом утрачивается до 56-60% белка - носителя антитоксической активности, сыворотка не полностью свободна от балластных белков и остатков пепсина, методика надежной инактивации которого еще не разработана. Именно поэтому для очистки и концентрирования ряда гетерологичных сывороточных препаратов используют методику выделения их гамма-глобулиновой фракции и интенсивно разрабатывают производственную технологию получения чистых антител методами специфической сорбции из сыворотки на иммуносорбентах - специфических антигенах, фиксированных на нерастворимых носителях. Если с помощью метода диаферм-3 производятся противостолбнячная, противодифтерийная, поливалентная противогангренозная, моно- и поливалентная противоботулиническая гетерологичные сыворотки, то также гетерологичные антирабическая сыворотка и сыворотка против клещевого энцефалита производятся в виде более очищенных и концентрированных препаратов гамма-глобулина. Перед выпуском производственных серий противостолбнячной сыворотки следует контролировать:
- физические свойства (сыворотка должна быть прозрачной, без хлопьев, осадка и посторонних включений; содержание белка не должно превышать 15%; рН должен быть в пределах 6,9-7,2);
- стерильность (в посевах на различные питательные среды не должны вырастать никакие микробы);
- пирогенность (у здоровых кроликов, получивших внутривенно сыворотку из расчета 1 мл на 1 кг массы тела, температура в прямой кишке не должна повышаться более чем на 0,8°С в первые 3 ч);
- безвредность (морские свинки, получившие подкожно в оба бока по 5 мл сыворотки, должны оставаться здоровыми в течение 5 дней наблюдения);
- специфическую активность (после 20-дневной выдержки сыворотки при 37°С в опытах абсолютной защиты белых мышей, получивших сыворотку разной концентрации в смеси с опытной дозой токсина, калиброванной по международному стандарту иммунной сыворотки определяют количество международных единиц - ME - антитоксина, содержащихся в 1 мл препарата).
Если результаты контрольных исследований удовлетворяют приведенным требованиям, столбнячную сыворотку, содержащую до 1000 и более ME в 1 мл, передают для профилактики или лечения столбняка в дозах, указанных в прилагаемом наставлении.
Так же контролируют свойства других гетерологичных иммунных сывороток, и лишь методика определения их специфической активности (количество ME в 1 мл), естественно, различается. Подобно вакцинам, иммунные сыворотки хранят в сухом затемненном месте при 3-10°С.