Реакции, основанные на феномене преципитации


Преципитация и агглютинация - это довольно сходные реакции, которые различаются главным образом на основании физических свойств антигена. В первом случае он представлен в растворимой, во втором - в корпускулярной формах. Преципитация, как и агглютинация - это реакция второго уровня, в основе которой лежит образование комплекса антиген-антитело. Существует зависимость преципитации и агглютинации от присутствия электролитов, однако специфичность этих реакций не вызывает сомнения. Процессы, происходящие при реакции преципитации, становятся более понятными с помощью схемы, в основу которой положена разработанная Marrack теория «решетки». Теория исходит из представления, что антитела двухвалентны, а антигены по своей структуре двух- или, как правило, поливалентны. Изменяя дозу антигена или концентрацию антител, можно определить оптимальное соотношение антиген-антитело. При повышении уровня антигена увеличивается и количество содержащихся в преципитате антител, вплоть до максимального. Максимальные концентрации - это так называемая эквивалентная зона, после которой антитела в преципитате более не выявляются. В зоне антигенного преобладания обнаруживают несвязанный антиген. Показатель соотношения дозы антигена с количеством молекул антител в преципитате достигает высоких значений. Все это приводит к торможению реакции и полному отсутствию преципитата. Данная теория была подтверждена в многочисленных исследованиях, однако необходимо иметь в виду, что процессы, протекающие в действительности, оказываются более сложными. Значительная роль принадлежит таким факторам, как аффинитет антител, степень очистки антигена и антител и другим.

Преципитация в растворах - это наиболее простой метод иммунологической диагностики. В целом он служит определению титра антител. Растворимый антиген в постоянной дозе (константная величина) добавляют к исследуемой антисыворотке, взятой в двукратных разведениях 1:2, 1:4, 1:8 и т. д. Картину преципитата можно оценить макроскопически, однако более точен учет реакции с помощью нефелометрии (по степени помутнения раствора), что позволяет автоматизировать процесс.

Особую форму преципитации в растворе представляет метод кольцепреципитации. На антисыворотку, помещенную в узкую пробирку, наслаивают раствор антигена: при положительном результате на границе растворов выпадает мутный осадок в виде кольца (точнее в виде шайбы), при использовании нормальной сыворотки (контроль) преципитация отсутствует.

Преципитация в геле. Широкое распространение получил метод с использованием агарового геля. Обычно концентрация агара составляет около 0,6%, но при определенных условиях может находиться в пределах 0,15-2%. Ячейки пространственной решетки геля имеют такой размер (3-6 нм), что белки могут проникать, а иммунные преципитаты, наоборот, задерживаются. Наряду с агаром или агарозой для этой реакции пригодны также желатин, ацетатцеллюлоза, акриламид и другие препараты.

Преципитацию наблюдают при оптимальном соотношении антиген-антитело. К преимуществам этой техники следует отнести высокую чувствительность метода, воспроизводимость теста с минимальными объемами реагентов, возможность установления различий в системе антител в зависимости от количества полос преципитации и выявления перекрестных реакций.

При постановке метода простой линейной диффузии один из двух реагентов включают в агар (обычно в агар замешивают специфические антисыворотки), в то время как другой - диффундирует в нем. При двойной диффузии антиген и антитела диффундируют навстречу друг другу. И, наконец, оба способа могут быть одно- и двухмерными. Метод может быть с успехом воспроизведен в чашках Петри. Для одного исследования необходимо всего 10-20 мкл сыворотки. Препараты можно окрасить для получения документированных результатов. Эти методы в комплексе с другими техническими приемами (изотопная метка) весьма перспективны.

1. Простая одномерная диффузия по J. Oudin. На агар, содержащий антисыворотку, наслаивают раствор антигена (или наоборот). За счет диффузии антигена в агар значительно снижается концентрация реагентов, что в определенный момент обеспечивает оптимальные условия для реакции преципитации. Период, в который проявляются линии преципитата, зависит главным образом от концентрации антител и их аффинности. Линии могут быть отчетливо видны уже через несколько часов, а при определенных условиях - через 1.0 дней и более. Использование различных систем антиген- антитело приводит к неодинаковому числу полос преципитации. Локализация линий преципитата зависит от концентрации, размера молекул и других физико-химических параметров реагентов.

2. Одномерная двойная диффузия в агаре по С. L. Oakley, A. J. Fulthorpe. В отличие от метода J. Oudin в данном случае как антиген, так и антисыворотка диффундируют в слой агара: при избытке дозы антигена линия преципитата расположена ближе к антисыворотке и наоборот.

3. Простая двухмерная диффузия. При этом методе агар, содержащий антитела, помещают в чашку Петри или на специальную пластину. Затем с помощью штампа в агаре делают лунки, куда вносят антиген: в результате его диффузии появляются концентрические кольца преципитации. Их миграция в агаре продолжается до тех пор, пока не произойдет полное связывание антигена. Диаметр кольца зависит от концентрации антигена и может служить количественным показателем реакции (техника Манчини). Наряду с исследуемым материалом (сывороткой больного) в лунки вносят раствор антигена уже известной концентрации (стандарт). Диаметр кольца преципитации, измеренный обычно через 2 дня, сравнивают со стандартом. Между концентрацией антигена (сывороточного Ig определенного класса) и показателем диаметра кольца преципитации можно с высокой степенью достоверности выявить определенную зависимость с помощью калибровочной кривой. Ошибка метода составляет 5-10%.

Этот метод обладает высокой чувствительностью, поскольку позволяет обнаружить антигены с концентрацией до 20 мг/л. Это универсальный, воспроизводимый и общепринятый тест. Определенную, сложность в работе представляет способность некоторых антигенов к полимеризации, а также подобные свойства некоторых мономеров 7S-IgM или низкомолекулярных продуктов распада (например, производных комплемента С3), что имеет место при болезнях иммунных комплексов. Данный тест используется главным образом для количественного определения Ig, компонентов комплемента и других белков сыворотки. Значительным преимуществом метода является возможность проведения массовых диагностических исследований.

4. Двойная двухмерная диффузия по Оухтерлони. При этом используют 0,5-2% раствор агара без дополнительных включений. Агар разливают в чашки Петри или на специальные пластины, в лунки, расположенные на противоположных сторонах его поверхности, вносят антиген или антисыворотку. Так как оба реагента диффундируют навстречу друг другу, между ними появляется линия преципитата. При эквивалентных дозах и сходных условиях диффузии антигена и антител следует ожидать прямую линию посередине - между двумя стартовыми лунками. При избытке одного из реагентов эта линия перемещается в направлении к противоположной стартовой лунке, что создает картину, описанную как дуга или арка преципитации. Особое преимущество метода состоит в возможности определения степени идентичности компонентов реакции. С этой целью обычно в агаре делают три лунки. В одну из них вносят антисыворотку, в другую - исследуемый антиген, а в третью - взятый для сравнительного анализа антиген (известный или неизвестный). Между лункой с сывороткой и двумя лунками с антигенами появляются дуги преципитата: при полной идентичности антигенов видны плавный переход и соединение линий, при частичной - происходит перекрестная реакция. Наряду с плавной линией отмечают так называемую шпору, которая направлена к лунке, не содержащей дополнительный антиген. При отсутствии идентичности наблюдают характерное пересечение линий преципитации.

5. Иммуноэлектрофорез. P. Grabar и С. Williams впервые разработали метод, в котором техника электрофореза была соединена с иммунодиффузионным анализом. Он особенно эффективен для исследования препаратов, содержащих смесь антигенов и антител. Опытную смесь вносят в стартовую лунку и разделяют с помощью электрофореза. Непосредственно после этого параллельно направлению миграции антигена с помощью специального штампа делают канавки, в которые вносят антисыворотку. Через несколько дней появляются линии преципитата разной степени выраженности, соответственно числу систем антиген-антитело. Их локализация зависит от электрофоретической подвижности компонентов реакции. Особенно широкое распространение иммуноэлектрофорез получил при диагностическом исследовании сывороток. Общепринятая техника позволяет идентифицировать около 30 различных линий преципитата. Характерные для IgG дуги преципитации проходят от катода до зоны глобулинов, что свидетельствует о гетерогенности IgG. Полоса, характерная для IgA, пересекается или соединяется с линией IgG, но затем следует к катоду в виде только одной дуги, расположенной под IgG-линией.

Иммуноэлектрофорез необходим при проведении качественного и полуколичественного анализов смесей препаратов, содержащих белки, при контроле за очисткой антигенов и антисывороток, диагностическом исследовании парапротеинов.

Для идентификации отдельных линий преципитата рекомендованы следующие способы:

- использование известной моноспецифической сыворотки, которую вносят в параллельную канавку;

- параллельное исследование электрофоретической подвижности известных антигенных компонентов;

- использование известных антигенных компонентов, которые вносят в параллельные канавки. В данном случае это приводит к удлинению с двух концов соответствующих полос преципитации, которые переходят в линию, параллельную дополнительной канавке.

Известны следующие модификации метода иммуноэлектрофореза.

1. Радиоиммуноэлектрофорез. Для получения меченых антител и антигенов применяют радиоактивную метку, что позволяет повысить чувствительность метода в 10-100 раз. Вместо радиоактивных изотопов можно использовать также флюоресцентные красители и ферменты.

2. Rocket-иммуноэлектрофорез или электроиммунодиффузия. При этой модификации антисыворотку смешивают с агаром. Антиген вносят в приготовленную лунку и подвергают электрофоретическому разделению. Исследование считается завершенным, когда окончательно формируется пик преципитата в форме ракеты. Высота полосы преципитации может служить параметром для определения концентрации антигена. Данный метод более чувствителен (выявляет до 10 мг/л антигена) и к тому же менее продолжителен, чем техника Манчини.

3. Перекрестный иммуноэлектрофорез. Прежде всего проводят электрофоретическое разделение антигенной смеси в агаровом геле. Затем слой геля, содержащего антиген, вырезают и переносят на специальную пластину, свободную поверхность которой заливают агаровым гелем; в последнем присутствует антисыворотка. Далее вновь воспроизводят технику электрофореза, но в направлении, перпендикулярном первому процессу. Анализ результатов аналогичен оценке rocket-иммуноэлектрофореза.

4. Встречный электрофорез. Осуществить постановку этой модификации можно при условии, если антигены и антитела мигрируют в электрическом поле навстречу друг другу. Преципитация происходит при встречном соединении двух потоков. Наряду с высокой чувствительностью метод не требует значительных затрат времени (учет результатов возможен уже через. 0,5-2 ч). Данную технику используют для выявления австралийского антигена, фетопротеина и продуктов распада фибрина. Аналогичным образом можно изучать особенности электрофоретической подвижности других препаратов.


Еще по теме:


Ваше имя:
Защита от автоматических сообщений:
Защита от автоматических сообщений Символы на картинке: