Сравнение единиц стрептокиназы, антистрептокиназы и антистрептолизина при разных методах определения
Сравнение единиц измерения стрептокиназы и антистрептокиназы, принятых в разных методах их определения. В литературе описаны четыре метода титрования стрептокиназы и антистрептокиназы: Каплана, Кристенсена, Коникова и Сачкова. Для определения антистрептокиназы предложена еще методика Бессермени. В каждом методе применяются свои условные единицы измерения. Понятно, что для сопоставления данных разных авторов, пользовавшихся одним или другим методом, необходимо сличить различные единицы измерения и получить возможность производить соответствующие пересчеты. Это составило задачу работы.
Сличение единиц измерения стрептокиназы. Для сравнения единиц стрептокиназы было проведено параллельное титрование одного и того же препарата всеми четырьмя методами и вычислено содержание стрептокиназы в единицах каждого метода. Оказалось, что 1,0 мл испытуемого раствора содержал 15 единиц стрептокиназы по Коникову, 1 единицу по Кристенсену и Сачкову и 8 единиц по Каплану.
Сравниваемые методы различались по количеству фибриногена в реакционной смеси и по времени учета лизиса. Между тем еще в 1947 г. Квест с сотрудниками указали на прямолинейную зависимость скорости лизиса сгустка под действием стрептокиназы от концентрации фибриногена. Для проверки этого положения был поставлен следующий опыт. Были приготовлены растворы фибриногена в фосфатном буфере с концентрацией от 25 до 1,5 мг/мл. В 5 параллельных рядов пробирок было разлито по 0,2 мл раствора стрептокиназы в падающей концентрации, во все пробирки добавляли по 0,1 мл человеческого тромбина и после встряхивания приливали в каждый ряд пробирок по 1,0 мл соответствующего раствора фибриногена. Пробирки снова встряхивали, помещали в водяную баню при 37° и отмечали по секундомеру время лизиса сгустка. Оказалось, что время лизиса было прямо пропорционально концентрации фибриногена, а количество единиц стрептокиназы, рассчитанное по формуле Коникова, обратно пропорционально количеству фибриногена.
Результаты этого опыта позволили объяснить в значительной степени различия между единицами измерения стрептокиназы при пользовании разными методами. В самом деле, при постановке реакции в модификации Сачкова количество фибриногена в 20-17 раз больше, чем в методе Коникова, и единица стрептокиназы оказалась в 15 раз большей. В методе Каплана количество фибриногена в 2-3 раза больше, чем в методе Коникова, единица стрептокиназы по Каплану соответственно в 2 раза больше.
При титровании стрептокиназы по Кристенсену применяется такое же количество фибрина, как и в методе Коникова, но в первом случае речь идет о гибридном фибрине. Между тем проведенные нами сравнительные опыты показали, что для лизиса гибридного фибрина требуется в 3-4 раза больше стрептокиназы по сравнению с человеческим фибрином. Помимо этого, следует учесть, что время учета лизиса укорочено в методе Кристенсена до 10 мин (вместо 30 мин по Коникову). Опыты показали, что для такого ускорения лизиса приходилось повысить количество стрептокиназы в 3,5-4 раза. В итоге единица Кристенсена должна оказаться в 14-16 раз больше единицы Коникова.
Соотношения между единицами антистрептокиназы (АСК) при определении разными методами. Методы Коникова и Кристенсена одинаковы по принципу определения дозы АСК, основанному на введении в реакционную смесь избыточного количества стрептокиназы и выявлении остаточной активности, свидетельствующей о сохранении одной единицы фермента. Они различаются по количеству фибриногена в реакционной смеси, по количеству стрептокиназы и по объему исследуемой сыворотки. Методика Сачкова основана на непосредственной нейтрализации одной единицы стрептокиназы; при этой методике вряд ли возможно дифференцировать полную нейтрализацию от частичной, что также приведет к отсутствию лизиса. Наконец, в методике Каплана оценка производится на основании частичной нейтрализации одной единицы стрептокиназы, что приводит к замедлению лизиса. Следует отметить, что лишь в методах Коникова и Каплана сохраняются количество фибриногена и общий объем реакционной смеси такими же, как при титровании стрептокиназы; в двух других методах этого нет, а в методе Кристенсена учет лизиса при титровании АСК производится не через 10, а спустя 30 мин.
Для сличения единиц АСК, определяемых посредством разных методов, были исследованы сыворотки детей, больных ревматизмом, каждым из них, а также посредством методики, разработанной Бессермени, которая основана на способе Кристенсена и выполняется посредством стандартных препаратов.
Титры антистрептокиназы, определенные по методам Коникова, Кристенсена и Бессермени, практически совпадают. При определении по методу Каплана титры оказались более высокими в 2 раза, а при определении по методу Сачкова - в 6 раз.
Совпадение титров антистрептокиназы, при пользовании методами Коникова и Кристенсена, можно, по-видимому, объяснить исходя из следующего расчета. Как приводилось выше, 2 единицы стрептокиназы Кристенсена эквивалентны 30 единицам по Коникову, но при титровании по Кристенсену применяется для нейтрализации фермента в 2 раза больше сыворотки (0,5 мл вместо 0,2 мл по Коникову). Если в опыте по Коникову нейтрализуются (согласно условию) взятым количеством сыворотки 9 единиц, то следует ожидать, что в опыте по Кристенсену будут нейтрализованы 22,5 единицы и останутся свободными 7,5 единиц (Коникова). Это намного больше того количества фермента, которое достаточно для лизиса сгустка фибрина, если он образован в условиях метода Коникова. Но при титровании по Кристенсену применяется в 2 раза большее количество гибридного фибриногена, который лизируется медленнее.
Аналогичным образом можно объяснить повышение значений АСК в 2 раза при титровании по Каплану по сравнению с данными по методу Коникова. В методе Каплана используется количество стрептокиназы, эквивалентное 2 единицам Коникова; нейтрализации подлежит 1 ед. вместо 9 и значение АСК могло бы повыситься в 9 раз. Но по методике Каплана применяется, во-первых, в 5 раз большее количество сыворотки (1,0 мл против 0,2 мл по Коникову) и, во-вторых, в 2 раза большее количество фибриногена. Это должно было бы снизить соответственно значение АСК и сравнять его со значением, которое определяется по методике Коникова. Однако время учета лизиса увеличено по Каплану вдвое (до 60 мин); иными словами, титр АСК учитывали не по нейтрализации одной единицы фермента, а дробной доли, что и приводило к повышению значения АСК.
Приведенные материалы позволяют, зная соотношения между единицами стрептокиназы и АСК при разных методах титрования сравнивать результаты разных исследований независимо от использованного метода. Следовало все же оценить, какой метод является наиболее легким, удобным и экономичным. Метод, описанный в книге В. И. Сачкова, является мало чувствительным для определения стрептокиназы в бульонных культурах стрептококка и экономически наименее выгоден (большой расход фибриногена). Для титрования же антистрептокиназы по этому методу используется даже при хорошем навыке в работе ряд в 6-10 пробирок с разными разведениями сыворотки. При этом в каждую пробирку добавляется 25 мг фибриногена. Таким образом, на титрование одной сыворотки расходуется от 150-200 мг фибриногена, т. е. количество, получаемое из 100 мл крови человека.
Методы Каплана, Кристенсена и Коникова значительно более экономичны. В том случае, если лаборатории приходится самой готовить необходимые реагенты, выгоднее пользоваться методом Коникова (или Каплана), для которого достаточно иметь один препарат (человеческий фибриноген) вместо двух (бычьего фибриногена и человеческого плазминогена), которые требуются по методике Кристенсена. Опасность наличия антител по отношению к стрептокиназе в человеческом фибриногене минимальна, так как по методике Коникова в реакционную смесь вносится всего 1 мг фибриногена, на котором могут сорбироваться максимально десятые доли единицы АСК. Кроме того, метод титрования стрептокиназы по Кристенсену менее чувствителен и может показать полное отсутствие стрептокиназы в тех бульонных культурах гемолитических стрептококков, в которых методы Коникова и Каплана ее открывают. Что касается титрования АСК, то при титровании по Коникову можно ограничиться рядом в 4-5 пробирок, так что на титрование одной сыворотки расходуется 4-5 мг фибриногена, т. е. в 50-40 раз меньше, чем в методе Сачкова.
Сличение единиц измерения стрептокиназы. Для сравнения единиц стрептокиназы было проведено параллельное титрование одного и того же препарата всеми четырьмя методами и вычислено содержание стрептокиназы в единицах каждого метода. Оказалось, что 1,0 мл испытуемого раствора содержал 15 единиц стрептокиназы по Коникову, 1 единицу по Кристенсену и Сачкову и 8 единиц по Каплану.
Сравниваемые методы различались по количеству фибриногена в реакционной смеси и по времени учета лизиса. Между тем еще в 1947 г. Квест с сотрудниками указали на прямолинейную зависимость скорости лизиса сгустка под действием стрептокиназы от концентрации фибриногена. Для проверки этого положения был поставлен следующий опыт. Были приготовлены растворы фибриногена в фосфатном буфере с концентрацией от 25 до 1,5 мг/мл. В 5 параллельных рядов пробирок было разлито по 0,2 мл раствора стрептокиназы в падающей концентрации, во все пробирки добавляли по 0,1 мл человеческого тромбина и после встряхивания приливали в каждый ряд пробирок по 1,0 мл соответствующего раствора фибриногена. Пробирки снова встряхивали, помещали в водяную баню при 37° и отмечали по секундомеру время лизиса сгустка. Оказалось, что время лизиса было прямо пропорционально концентрации фибриногена, а количество единиц стрептокиназы, рассчитанное по формуле Коникова, обратно пропорционально количеству фибриногена.
Результаты этого опыта позволили объяснить в значительной степени различия между единицами измерения стрептокиназы при пользовании разными методами. В самом деле, при постановке реакции в модификации Сачкова количество фибриногена в 20-17 раз больше, чем в методе Коникова, и единица стрептокиназы оказалась в 15 раз большей. В методе Каплана количество фибриногена в 2-3 раза больше, чем в методе Коникова, единица стрептокиназы по Каплану соответственно в 2 раза больше.
При титровании стрептокиназы по Кристенсену применяется такое же количество фибрина, как и в методе Коникова, но в первом случае речь идет о гибридном фибрине. Между тем проведенные нами сравнительные опыты показали, что для лизиса гибридного фибрина требуется в 3-4 раза больше стрептокиназы по сравнению с человеческим фибрином. Помимо этого, следует учесть, что время учета лизиса укорочено в методе Кристенсена до 10 мин (вместо 30 мин по Коникову). Опыты показали, что для такого ускорения лизиса приходилось повысить количество стрептокиназы в 3,5-4 раза. В итоге единица Кристенсена должна оказаться в 14-16 раз больше единицы Коникова.
Соотношения между единицами антистрептокиназы (АСК) при определении разными методами. Методы Коникова и Кристенсена одинаковы по принципу определения дозы АСК, основанному на введении в реакционную смесь избыточного количества стрептокиназы и выявлении остаточной активности, свидетельствующей о сохранении одной единицы фермента. Они различаются по количеству фибриногена в реакционной смеси, по количеству стрептокиназы и по объему исследуемой сыворотки. Методика Сачкова основана на непосредственной нейтрализации одной единицы стрептокиназы; при этой методике вряд ли возможно дифференцировать полную нейтрализацию от частичной, что также приведет к отсутствию лизиса. Наконец, в методике Каплана оценка производится на основании частичной нейтрализации одной единицы стрептокиназы, что приводит к замедлению лизиса. Следует отметить, что лишь в методах Коникова и Каплана сохраняются количество фибриногена и общий объем реакционной смеси такими же, как при титровании стрептокиназы; в двух других методах этого нет, а в методе Кристенсена учет лизиса при титровании АСК производится не через 10, а спустя 30 мин.
Для сличения единиц АСК, определяемых посредством разных методов, были исследованы сыворотки детей, больных ревматизмом, каждым из них, а также посредством методики, разработанной Бессермени, которая основана на способе Кристенсена и выполняется посредством стандартных препаратов.
Титры антистрептокиназы, определенные по методам Коникова, Кристенсена и Бессермени, практически совпадают. При определении по методу Каплана титры оказались более высокими в 2 раза, а при определении по методу Сачкова - в 6 раз.
Совпадение титров антистрептокиназы, при пользовании методами Коникова и Кристенсена, можно, по-видимому, объяснить исходя из следующего расчета. Как приводилось выше, 2 единицы стрептокиназы Кристенсена эквивалентны 30 единицам по Коникову, но при титровании по Кристенсену применяется для нейтрализации фермента в 2 раза больше сыворотки (0,5 мл вместо 0,2 мл по Коникову). Если в опыте по Коникову нейтрализуются (согласно условию) взятым количеством сыворотки 9 единиц, то следует ожидать, что в опыте по Кристенсену будут нейтрализованы 22,5 единицы и останутся свободными 7,5 единиц (Коникова). Это намного больше того количества фермента, которое достаточно для лизиса сгустка фибрина, если он образован в условиях метода Коникова. Но при титровании по Кристенсену применяется в 2 раза большее количество гибридного фибриногена, который лизируется медленнее.
Аналогичным образом можно объяснить повышение значений АСК в 2 раза при титровании по Каплану по сравнению с данными по методу Коникова. В методе Каплана используется количество стрептокиназы, эквивалентное 2 единицам Коникова; нейтрализации подлежит 1 ед. вместо 9 и значение АСК могло бы повыситься в 9 раз. Но по методике Каплана применяется, во-первых, в 5 раз большее количество сыворотки (1,0 мл против 0,2 мл по Коникову) и, во-вторых, в 2 раза большее количество фибриногена. Это должно было бы снизить соответственно значение АСК и сравнять его со значением, которое определяется по методике Коникова. Однако время учета лизиса увеличено по Каплану вдвое (до 60 мин); иными словами, титр АСК учитывали не по нейтрализации одной единицы фермента, а дробной доли, что и приводило к повышению значения АСК.
Приведенные материалы позволяют, зная соотношения между единицами стрептокиназы и АСК при разных методах титрования сравнивать результаты разных исследований независимо от использованного метода. Следовало все же оценить, какой метод является наиболее легким, удобным и экономичным. Метод, описанный в книге В. И. Сачкова, является мало чувствительным для определения стрептокиназы в бульонных культурах стрептококка и экономически наименее выгоден (большой расход фибриногена). Для титрования же антистрептокиназы по этому методу используется даже при хорошем навыке в работе ряд в 6-10 пробирок с разными разведениями сыворотки. При этом в каждую пробирку добавляется 25 мг фибриногена. Таким образом, на титрование одной сыворотки расходуется от 150-200 мг фибриногена, т. е. количество, получаемое из 100 мл крови человека.
Методы Каплана, Кристенсена и Коникова значительно более экономичны. В том случае, если лаборатории приходится самой готовить необходимые реагенты, выгоднее пользоваться методом Коникова (или Каплана), для которого достаточно иметь один препарат (человеческий фибриноген) вместо двух (бычьего фибриногена и человеческого плазминогена), которые требуются по методике Кристенсена. Опасность наличия антител по отношению к стрептокиназе в человеческом фибриногене минимальна, так как по методике Коникова в реакционную смесь вносится всего 1 мг фибриногена, на котором могут сорбироваться максимально десятые доли единицы АСК. Кроме того, метод титрования стрептокиназы по Кристенсену менее чувствителен и может показать полное отсутствие стрептокиназы в тех бульонных культурах гемолитических стрептококков, в которых методы Коникова и Каплана ее открывают. Что касается титрования АСК, то при титровании по Коникову можно ограничиться рядом в 4-5 пробирок, так что на титрование одной сыворотки расходуется 4-5 мг фибриногена, т. е. в 50-40 раз меньше, чем в методе Сачкова.