Лабораторные и инструментальные методы, используемые для диагностики хронического гепатита у детей


Методы определения поверхностного антигена гепатита В (HBsAg). Блумберг с соавторами, проводя обширные исследования полиморфизма сывороточных белков человека, выявили в крови австралийского аборигена неизвестный ранее антиген. Дальнейшее изучение показало, что обнаруженный антиген (обозначенный как Австралийский Au-антиген) с повышенной частотой выявляется в крови больных с синдромом Дауна (находящихся в специализированных учреждениях), лейкозом и лепроматозной формой проказы. Однако ни при одном из перечисленных заболеваний не установлено этиологической роли Аи-антигена.

В 1965 году Блумберг с соавторами сообщили о значительной частоте антигенемии у больных вирусным гепатитом, а в 1968 году Принс подтвердил это наблюдение, усовершенствовав и упростив метод преципитации в геле для его определения.

К настоящему времени с несомненностью установлено, что Австралийский антиген тесно связан с вирусом гепатита В. При электронной микроскопии определяются три вида частиц Au-антигена: мелкие шаровидные частицы до 20 нм в диаметре, палочковидные образования того же диаметра, а также более крупные частицы размером до 40-50 нм, так называемые частицы Дейна, которые, как предполагается, представляют собой частицы вируса, в то время как две первые формы - избыточный белковый материал оболочки вирусов.

По новейшим данным, формирование полной частицы вируса гепатита В происходит следующим образом: в ядре гепатоцита репродуцируется (под воздействием вирусной РНК) центральная (ядерная) частица (ядерный антиген гепатита В), которая затем выходит в цитоплазму гепатоцита, где дозревает и "одевается" поверхностной оболочкой из HBsAg (поверхностного антигена гепатита В), синтезируемого в цитоплазме. В этом виде частица Дейна проходит через оболочку гепатоцита. В сыворотке крови лиц, заболевших гепатитом В, HBsAg обнаруживается через 3-5 недель после инфицирования (значительно раньше, чем появляются клинические и биохимические признаки болезни). Исчезновение HBsAg совпадает с началом выздоровления или предшествует ему. В ряде случаев HBsAg остается в крови длительное время. Такое персистирование антигенемии в большинстве случаев наблюдается при хроническом течении процесса. В начальном периоде гепатита В, в зависимости от чувствительности используемых методов, удается определить HBsAg в сыворотке крови в 55-100% случаев. Он может также быть обнаружен в гепатоцитах методом иммунофлюоресценции.
 
HBsAg является слабым антигенным раздражителем, вероятно, в силу наличия в его составе антигенных детерминант, сходных с собственными белками человека. Антитела к HBsAg удается обнаружить в крови острых больных и реконвалесцентов только при использовании высокочувствительных методов, какими являются радиоиммунные и реакция прилипания - гемагглютинации. Значительно более высокие титры антител к HBsAg определяются в сыворотке крови лиц, многократно получавших трансфузии крови - чаще всего у больных гемофилией, гипопластической анемией и другими заболеваниями. В частности, Г. С. Благословенским и В. С. Абрамовым антитела к HBsAg найдены у 16 из 41 обследованного больного гемофилией (39,9%), при этом у 8 из них - в высоком титре.

Исследованием Блумберга впервые установлено наличие подтипов HBsAg, характеризующихся полным совпадением всех физико-химических свойств при наличии антигенных различий. Дальнейшими исследованиями выяснено, что во всех сыворотках, содержащих HBsAg, имеется детерминанта "а". Кроме того, определяются две другие системы детерминант: "у" или "d" и "w" или "r", как правило, взаимно исключающие друг друга. Полагают, что путем субтипирования HBsAg можно уточнить как пути инфицирования, так и особенности распространения инфекции в различных географических зонах и среди изолированных контингентов.

Существует несколько методов определения антигена и антител к нему. Самым простым является метод преципитации в агаровом геле (или реакция двойной иммунодиффузии в геле по Ухтерлони) в модификации Принса. Достоинствами реакции Ухтерлони являются также ее высокая специфичность, отсутствие ложноположительных и ложноотрицательных результатов, малый расход материалов и возможность определения полноты антигенной идентичности. Недостатками ее являются минимальная чувствительность и получение предварительного ответа через 24 ч, а окончательного - лишь спустя 48-72 ч. Последнее обстоятельство ограничивает возможность применения реакции Ухтерлони для обследования доноров, так как необходима выдача результатов в день сдачи крови.

Реакция иммуносмоэлектрофореза (или встречного иммунэлектрофореза) в агаровом геле по чувствительности идентична реакции Ухтерлони, но уступает ей по специфичности, что было показано нами путем параллельного определения HBsAg в 1000 сыворотках двумя названными методами.

Применяется также реакция связывания комплемента (РСК), обладающая более высокой чувствительностью, но применение ее лимитируется тем обстоятельством, что в крови больных вирусным гепатитом со значительной частотой присутствует антикомплементарный фактор, нередко обусловливающий ложные результаты (поэтому требуется дополнительное определение антикомплементарного фактора).

Разработан ряд сложных методов: несколько модификаций радиоиммунных, с использованием меченых радиоактивными веществами антител или антигена, и реакции: торможения гемагглютинации и иммуноприлипания - гемагглютинации.

Следует отметить, что метод иммунодиффузии по Ухтерлони наиболее прост и отличается высокой специфичностью.

Энзимный спектр сыворотки крови. Развитие клинической энзимологии вооружило клинициста весьма чувствительным методом определения целлюлярной патологии.

Как известно, печень представляет собой основной орган, в котором происходят многообразные химические реакции, обеспечивающие жизнедеятельность всех систем организма. В этой большой "лаборатории" в реакциях обмена участвует огромное количество различных энзимов (сложных протеинов, синтезируемых в рибосомах клеток).

Классификации энзимов, используемых для диагностики, приведены нами ранее. Следует лишь подчеркнуть, что ряд энзимов внутриклеточной локализации (осуществляющих свою функцию исключительно внутри клеток) в физиологических условиях отсутствует в циркулирующей крови или обнаруживается в ней в минимальных количествах.

Большинство катализируемых индикаторными энзимами реакций происходит не только в гепатоцитах, но и в других клетках организма.

Лишь немногие из индикаторных энзимов могут быть отнесены к группе органоспецифических для печени, так как они находятся почти исключительно в гепатоцитах.

Наряду с приведенными данными следует отметить, что энзимы локализуются в различных клеточных структурах. Большинство из них входит в состав цитоплазмы, лишь ACT и МДГ имеют двойную локализацию (как в цитоплазме, так и в митохондриях). Особое положение занимает органоспецифический энзим углеводного обмена глутаматдегидрогеназа (ГлДГ), локализующийся исключительно в митохондриях и прочно связанный с ними. Выход этого энзима происходит при гибели гепатоцита, и потому определение ГлДГ может быть использовано для характеристики глубины поражения печени.

Большинство исследователей полагают, что гиперферментемия обусловлена проникновением энзима из клеток в кровоток при нарушении проницаемости мембран. При некрозе клеток происходит массивный выход энзимов, после чего уровень их в сыворотке падает вследствие гибели клеток, их продуцирующих.

Поступление энзимов в кровеносное русло зависит также от величины их молекул. Так, энзимы с низкой относительной молекулярной массой довольно легко проходят сквозь мембраны клеток, а ГлДГ при относительной молекулярной массе порядка 1 000 000 попадает в кровоток лишь при разрушении гепатоцита.

Главной причиной гиперферментемии, по мнению Поппера, является катаболическая альтерация органелл гепатоцитов в сочетании с повышением проницаемости клеточных мембран. Кроме того, активность энзимов, уже попавших в сосудистое русло, меняется в зависимости от скорости их выведения, инактивации и разрушения.
 
Таким образом, как локализация патологического процесса, так и молекулярный вес энзимов обусловливают неодинаковое повышение их активности в сыворотке крови. Поэтому одновременное определение активности нескольких энзимов (так называемого энзимного спектра сыворотки крови) предоставляет возможность получения значительно более достоверной информации о состоянии гепатоцитов, нежели изолированное определение какого-либо одного энзима. При этом следует также отметить, что информативность различных энзимных тестов неодинакова, наибольшая при определении трансфераз (АЛТ и ACT) и органоспецифических энзимов - ГлДГ, Ф-1-МФА и ИДГ. Так, при остром вирусном гепатите в начальном периоде болезни при значительной распространенности воспалительных изменений активность аминотрансфераз достигает больших величин. Если же процесс носит очаговый характер, как это бывает при безжелтушном гепатите с умеренно выраженными явлениями альтерации, то активность как митохондриального энзима ГлДГ, так и цитоплазматических энзимов умеренно повышена.

Иные отношения складываются при распространенном патологическом процессе с массивной альтерацией, при котором активность аминотрансфераз и других энзимов цитоплазматической локализации резко повышена, высоких показателей достигает и активность ГлДГ.

При хроническом гепатите лишь в фазе обострения происходит поражение значительного числа гепатоцитов, результатом чего является выраженная гиперферментемия. При умеренной распространенности воспалительного процесса определяется увеличенная активность трансфераз (с преобладанием ACT) и других цитоплазматических энзимов и лишь незначительно повышенная активность ГлДГ.

Мы считаем целесообразным следующий набор энзимных тестов для характеристики процесса и оценки эффективности терапии - определение ACT, Ф-1-МФА и ГлДГ; остальным принадлежит вспомогательная роль.

Сопоставление активности ряда энзимов раскрывает перед клиницистом возможности своевременной диагностики и контроля состояния патологического процесса.

Электрофоретические методы исследования белков сыворотки крови на полиакриламидном геле (ПААГ). Исследование сывороточных протеинов является одним из тестов, отражающих функциональное состояние печени. Хорошо известно, что в печени происходит синтез всего альбумина и 80% глобулинов путем дезаминирования и переаминирования аминокислот с последующим включением их в синтезируемые белковые молекулы.

При поражении печени у больных нарушаются процессы окислительного фосфорилирования, снижается концентрация АТФ и НАД, ацетил-коэнзима А, происходит повышение проницаемости клеточных мембран и, наконец, снижение биоэлектрического потенциала гепатоцита. Все перечисленное приводит к нарушению обмена белков, что проявляется изменением белкового спектра сыворотки крови.

В 1957 году Остер использовал в качестве поддерживающей среды полиакриламидный гель (ПААГ). Метод электрофореза на ПААГ был предложен Орншейном в 1959 году. Сепарирование белковой смеси обусловлено применением неоднородной разделяющей системы с полиакриламидный гелем в качестве носителя. Различные слои геля отличаются друг от друга величиной пор, что и обусловливает сначала концентрирование исследуемых протеинов в узкой стартовой зоне крупнопористого геля, а затем разделение в мелкопористом его слое. Таким образом, высокая разрешающая способность электрофореза на ПААГ обусловлена как эффектом концентрации, так и эффектом "молекулярного сита". Используя различные модификации электрофореза белков на ПААГ, можно обнаружить от 30 до 50 их компонентов. К белкам, которые определяются этим методом, относятся: преальбумин, альбумины, группоспецифический компонент  и другие.

Преальбумин обладает максимальной электрофоретической подвижностью. Электрофорез выявляет полиморфизм данного белка, что свидетельствует о гетерогенности молекулярных типов преальбумина. Фагернольд с сотрудниками выявили наличие трех кодоминантных аллелей, обусловливающих быструю, среднюю и медленную его подвижность. Физиологическое значение преальбумина не выяснено.

При остром вирусном гепатите в зоне преальбуминов А. Ф. Блюгер с соавторами обнаружили протеины (чаще в периоде разгара болезни), однако диагностическое значение обнаружения данной белковой фракции не подтверждено другими исследователями.

Альбумины синтезируются гепатоцитами. Они обладают выраженной электрофоретической подвижностью, их сульфгидрильные группы гетерогенны. Методом двухмерного электрофореза у некоторых лиц выявляется бисальбуминемия - наличие альбумина А с более быстрой и альбумина В с более медленной электрофоретической подвижностью. Наряду с наследственным полиморфизмом может иметь место и преходящая бисальбуминемия, возникновение которой связано с введением больших доз пенициллина. Почти при всех патологических состояниях уровень альбумина оказывается сниженным.

Группоспецифический компонент Gc имеет различия в строении, обусловленные типом наследования, и состоит из быстро мигрирующего и медленно мигрирующего компонентов. Данный белок термолабилен и после прогревания в течение 30 мин при 58° определить его тип не удается. Физиологическое значение указанного протеина не изучено.

Церулоплазмин представляет собой а2-глобулин, в молекулу которого входит 8 атомов прочно связанной меди. В плазме крови человека содержится 0,15- 0,30 г/л церулоплазмина.

Наследуемые варианты церулоплазмина представлены пятью формами, имеющими различную электрофоретическую подвижность; форма В распространена значительно чаще, чем А, а другие подтипы крайне редки. Рядом исследователей установлена связь между наследованием типа церулоплазмина и предрасположенностью человека к тому или иному заболеванию. Так, у больных проказой встречается редкий фенотип церулоплазмина. У больных гепатоцеребральной дистрофией содержание церулоплазмина резко снижено, что обусловливает развитие клинических симптомов болезни.

В нашей клинике проведено изучение содержания церулоплазмина и меди в крови больных вирусным гепатитом. Установлено, что содержание церулоплазмина при остром гепатите увеличено, но коэффициент отношения меди к церулоплазмину не изменен. При хроническом гепатите концентрация церулоплазмина также остается в пределах физиологической нормы. В стадии декомпенсированного цирроза содержание этого белка, по данным Пинеда и соавторов, снижено, а по П. М. Альперину и А. А. Замчий - повышено.

Трансферрин относится к Бета-глобулинам, его синтез осуществляется в гепатоцитах и РЭС. Он выполняет транспортную роль, доставляя железо в костный мозг, а также тормозит размножение многих патогенных вирусов. Снижение уровня данного белка регистрируется при ряде инфекционных заболеваний, при лейкозах и злокачественных новообразованиях. Известно 19 типов трансферрина, отличных по величине заряда молекулы. С наибольшей частотой определяется трансферрин С. Сведения об уровне трансферрина у больных вирусным гепатитом противоречивы. При хроническом течении процесса содержание его в сыворотке крови не превышает пределов физиологической нормы.

Гаптоглобин относится к гликопротеидам и составляет от 10 до 30% глобулиновой фракции, синтезируется в гепатоцитах и принимает участие в межуточном обмене железа. Уолкер и сотрудники в 1955 году открыли три типа гаптоглобина, различающихся по электрофоретической подвижности. Следует отметить, что сейчас известны и другие типы гаптоглобина, которые встречаются крайне редко. Отмечено также, что существуют люди, у которых нет гаптоглобина.

Исследований, посвященных изучению уровня гаптоглобина у больных с поражением печени, довольно много. В них отражено преимущественно количественное содержание протеина. Снижение уровня данного гликопротеида у взрослых, больных вирусным гепатитом, регистрируется в 90% случаев. У больных хроническим гепатитом также было установлено снижение его концентрации.

Альфа-2-микроглобулин - один из "тяжелых" белков. Физиологическое значение его еще окончательно не установлено. Однако известно, что он является ингибитором плазмина, и увеличение его концентрации может привести к развитию тромбоза. При остром вирусном гепатите содержание этого белка увеличено.

Что же касается бета-липопротеида и гамма-глобулинов, выделяемых электрофорезом на ПААГ, то функции, которые они выполняют, и характер изменений их содержания при различных заболеваниях отражены в значительном количестве публикаций.

Приведенные краткие характеристики тех фракций, которые могут быть выделены путем электрофореза на ПААГ, позволяют сделать заключение, что названный метод является одним из самых перспективных для изучения белкового состава сыворотки крови, позволяет выявить не менее 18 фракций и раскрывает возможность выявления парапротеинов, а также генетических особенностей сывороточных систем крови.

Иммуноглобулины. К иммуноглобулинам относят белки животного происхождения, обладающие активностью антител, а также белки, сходные с ними по химической структуре и антигенной специфичности. В молекулах иммуноглобулинов имеются "тяжелые" углеводные цепи, несущие антигенную детерминанту, обусловленную аминокислотным составом, содержанием углеводных компонентов и антигенными свойствами, общие же для иммуноглобулинов детерминанты располагаются в "легких" цепях.

Основными свойствами иммуноглобулинов является их способность соединяться с соответствующими антигенами, фиксировать комплемент, вызывать воспалительную реакцию с участием тучных клеток (в результате образования иммунных комплексов антигена с антителом). В настоящее время в соответствии с Международной классификацией, принятой в 1964 году в Праге, выделяют 5 классов иммуноглобулинов (Ig): IgA, IgM, IgG, IgE и IgD. Различают 4 подкласса IgG и 2 подкласса IgM и IgA.

Иммуноглобулины G (IgG),относительная молекулярная масса которых достигает 150 000, составляют основную часть иммуноглобулинов (71%). Белок обладает минимальной подвижностью в электрическом поле. Это единственный из иммуноглобулинов, проникающий сквозь плацентарный барьер, так что новорожденный получает от матери только IgG. Данный класс Ig имеет генетический маркер Gm, является наиболее активным, в реакциях нейтрализации вирусов и токсинов, а также обусловливает аллергические реакции анафилактического типа.

Страница 1 - 1 из 2
Начало | Пред. | 1 2 | След. | Конец


Еще по теме:


Ваше имя:
Защита от автоматических сообщений:
Защита от автоматических сообщений Символы на картинке: